Производство антибиотиков

1. Общая характеристика  антибиотиков

Термин «антибиотик» был предложен в 1942 г. С. А. Ваксманом для обозначения веществ, образуемых микроорганизмами и обладающих антимикробным действием. Впоследствии многие исследователи предлагали свои формулировки, вкладывая в них подчас слишком ограниченное содержание либо чрезмерно расширяя это понятие.В настоящее время под антибиотиками понимают химиотерапевтические вещества, полученные из микроорганизмов или иных природных источников, а также их полусинтетические аналоги и производные, обладающие способностью избирательно подавлять в организме больного возбудителей заболеваний и задерживать развитие злокачественных новообразований. Антибиотики природного происхождения продуцируются различными группами микроорганизмов, низшими растениями, высшими растениями и животными организмами.Например, представители родов Micrococcus, Streptococcus, Diplocoooccus, Chromobacterium, Escherichia, Proteus синтезируют низин, дипломицин, продигиозин, колиформин. Бактерии рода Bacillus образуют грамицидины, субтилин, полимиксины. Антибиотики, образуемые микроорганизмами, принадлежащими к ряду Actinomycetales, - стрептомицин, тетрациклины, новобиоцин, актиномицины и др. Антибиотики, образуемые несовершенными грибами: пенициллин - Penic. Chrysogenum; гризеофульвин - Penic. Griseofulnum; трихоцетин - Tricholecium roseum. Антибиотики животного происхождения: лизоцим, экмолин, круцин, интерферон.

Классификация антибиотиков. По характеру воздействия  на бактериальную клетку антибиотики  можно разделить на три группы:

- бактериостатические  (бактерии живы, но не в состоянии  размножаться),

- бактерициды  (бактерии умертвляются, но физически  продолжают присутствовать в  среде),

- бактериолитические (бактерии умертвляются, и бактериальные клеточные стенки разрушаются).

Выражение величин  биологической активности антибиотиков обычно производят в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или в 1 мг препарата (ед/мг). За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроба в определенном объеме питательной среды.

Применение антибиотиков. Антибиотики представляют собой  самую многочисленную группу лекарственных  средств. Они используются для предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. Сейчас существуют сотни лекарственных  средств, избирательно действующих  на возбудителей различных заболеваний. Сфера антибиотиков - это быстро прогрессирующие инфекции или бактериальное  заражение жизненно важных органов, с которыми иммунная система не может  справиться сама. Антибиотики незаменимы при остром развитии болезни - ангины и пневмонии, а также при инфекционном воспалении, которое локализуется в закрытых полостях (отит, гайморит, остеомиелит, абсцесс, флегмона). В настоящее время ведутся активные работы по изысканию антибиотиков нового поколения, эффективных при лечении вирусных и раковых заболеваний. Антибиотики находят применение в сельском хозяйстве, прежде всего как лечебные препараты в животноводстве, птицеводстве, пчеловодстве и растениеводстве, а отдельные антибиотические вещества - как стимуляторы роста животных. Некоторые из антибиотиков с успехом применяются в пищевой и консервной промышленности в качестве консервантов скоропортящихся продуктов (свежей рыбы, мяса, сыра, различных овощей). 

2. Особенности получения  антибиотиков

Процесс получения  антибиотика включает в себя следующие  основные стадии (рис. 1):

1. получение  соответствующего штамма — продуцента  антибиотика, пригодного для промышленного  производства;

2. биосинтез  антибиотика;

3. выделение  и очистка антибиотика;

4. концентрирование, стабилизация антибиотика и получение  готового продукта.

Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза

3. Производство пенициллина

Пенициллин был  открыт в 1929 г. Александром Флемингом  и был выделен в кристаллическом  виде 1940 году. Установлено, что пенициллин оказывает антимикробное действие в отношении некоторых грамположительных бактерий (стафиллококков, стрептококков, диплококков и некоторых других) и практически неактивен в отношении грамотрицательных видов и дрожжей. Способность образовывать пенициллин широко распространена среди многих плесневых грибов, относящихся к родам Penicillium и Aspergillus. Однако это свойство более характерно для группы Penicillium notatum-chrysogenum. Первые выделенные из естественных субстратов штаммы как наиболее активные продуценты пенициллина образовывали не более 20 единиц (12 мкг) антибиотика на 1 мл культуральной жидкости. В результате широкой научной работы по селекции новых активных штаммов продуцентов пенициллина получены различные штаммы Penicillium chrysogenum, которые, в отличие от исходных штаммов, обладают высокой продуктивностью и используются в промышленности. В настоящее время в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 15000 ед/мл, а отдельные штаммы способны синтезировать антибиотик в количестве до 25 тыс. ед/мл.

Под названием  «пенициллин» объединена обширная группа веществ, которые являются N-ацильными производными гетероциклической аминокислоты. Из природных пенициллинов применяются бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин.

3.1 Технологическая  схема производства  пенициллина

3.2 Изложение технологического  процесса

3.2.1 Подготовка инокулята

Подготовка посевного  материала включает следующие стадии:

1) выращивание  посевного мицелия 1-й генерации  в аппаратах малой емкости  (инокуляторах);

2) выращивание  посевного мицелия 2-й генерации  в аппаратах большой емкости.

Споровая культура, используемая для засева инокулятора, выращивается на пшене в стеклянных флаконах, высушивается и в таком виде хранится при комнатной температуре. Засев производят сухими спорами из 2-3 флаконов.

Основной задачей  при культивировании продуцента пенициллина в посевных аппаратах  на стадии подготовки инокулята является быстрое получение большой массы мицелия, способного обеспечить при пересеве в ферментер интенсивный рост и высокий выход антибиотика. Для осуществления этой задачи продуцент необходимо выращивать на средах, богатых легкоусвояемыми питательными веществами, в условиях хорошей аэрации, при оптимальной для роста микроорганизма температуре. В качестве легкоусвояемого углерода выступает глюкоза, сахароза и т.д. В качестве второго источника углерода применяют в небольших количествах лактозу, присутствие которой в среде для выращивания посевного мицелия желательно по следующей причине: ее потребление начинается не сразу, а после некоторого периода адаптации (привыкания), в течение которого происходит образование фермента, расщепляющего лактозу. Посевной мицелий, выращенный на среде, содержащей лактозу, обладает более высокой ферментативной активностью по отношению к трудноусвояемой лактозе и быстрее потребляет ее, что положительно сказывается на ходе ферментации.

3.2.2 Процесс ферментации

Ферментация является основной стадией в производстве пенициллина, на которой формируется  целевой продукт. В промышленности применяется метод глубинной  ферментации, при котором культура микроорганизма выращивается в питательной  среде, заполняя весь ее объем. У различных  штаммов потребность в источниках питания неодинакова. В связи  с этим состав сред не является постоянным и универсальным для всех продуцентов, образующих пенициллин, и меняется с появлением новых штаммов.Для получения максимального выхода пенициллина основные компоненты среды должны входить в ее состав в строго определенных соотношениях и концентрациях.

Основными показателями, свидетельствующими об окончании ферментации, являются полное исчезновение углеводов  в культуральной жидкости и прекращение биосинтеза антибиотика. Процесс ферментации в производственных условиях осуществляется при температуре 26±10С и продолжается обычно 120-125 часов.

3.2.3 Фильтрация

Обычно для  отделения мицелия от культуральной жидкости применяют вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Фильтрацию начинают до начала автолиза мицелия, поскольку при фильтрации автолизированной культуры мицелий не образует плотной пленки на фильтрующей поверхности барабана, а налипает в виде отдельных тонких комков, которые сами не отходят в зоне «отдувки» фильтра, и их приходится удалять вручную. При этом продолжительность фильтрации увеличивается в 2 - 3 раза, выход фильтрата резко падает, а сам фильтрат получается очень мутным. Необходимо тщательно соблюдать условия, препятствующие разрушению пенициллина во время фильтрации, - охлаждение нативного раствора до 4-6°С и систематическая (после каждой загрузки) обработка фильтра, коммуникаций и сборников антисептиками, например хлорамином. Фильтр также должен систематически стерилизоваться острым паром.

3.2.4 Предварительная  обработка нативного раствора

Нативный раствор (фильтрат культуральной жидкости) представляет собой более или менее мутную, окрашенную в желто-коричневый или зеленовато-коричневый цвет жидкость. Величина рН среды в зависимости от штамма продуцента, состава среды и продолжительности процесса ферментации обычно колеблется от 6,2 до 8,2. Очень важной характеристикой нативного раствора является содержание в нем белковых веществ, определяемых осаждением трихлоруксусной кислотой или другим соответствующим методом. Применяется несколько способов предварительной обработки нативного раствора с целью освобождения от белковых примесей: осаждение солями многовалентных металлов (например, А13+ Fе3+ или Zn2+), коагуляция танином, термическая коагуляция при температуре 60-75°С и рН 5,5 - 6,0, осаждение примесей катионными детергентами типа четвертичных аммониевых оснований (например, цетилпиридиний-бромидом или додецилтриметиламмонийхлоридом и т.п.). Применение этих методов приводит к потерям антибиотика. Обычно в результате коагуляции и последующей фильтрации или сепарирования теряется от 5 до 15%) пенициллина. При этом коагуляция солями металлов позволяет удалять не более 50% общего количества белковых веществ.

3.2.5 Экстракция и очистка  пенициллина

 В промышленности извлечение активного вещества из нативного раствора основано на экстракции не смешивающимся с водой растворителем при подавленной диссоциации карбоксильной группы пенициллина. В растворитель, кроме пенициллина, переходит большая часть органических кислот. Минеральные загрязнения, большая часть азотистых соединений и других органических веществ остаются в водной фазе, так что в результате экстракции чистота продукта увеличивается в 4-6 раз.

К растворителям, применяемым для экстракции пенициллина, предъявляются следующие основные требования:

1) малая растворимость  в воде;

2) отсутствие  взаимодействия с пенициллином;

3) низкая упругость  пара при температуре 5—30°С;

4) возможность  регенерации при температуре  не выше 120 — 140°;

5) низкая стоимость.

3.2.5 Выделение кристаллических  солей пенициллина

Наиболее надежным методом, обеспечивающим получение  кристаллического пенициллина хорошего качества, является выделение бензилпенициллина из бутилацетатного экстракта в виде концентрированного водного раствора калиевой соли с последующим упариванием воды с бутанолом под вакуумом, что приводит к кристаллизации калиевой соли из бутилового спирта.

Этот процесс  имеет следующую технологическую  последовательность:

1. Обезвоживание  бутилацетатного экстракта путем охлаждения до —16-18°С с последующей фильтрацией от льда. Удаление пигментных загрязнений обработкой активированным углем и фильтрацией на охлажденном друк-фильтре.

2. Получение  концентрата калиевой соли бензилпенициллина экстракцией 0,56—0,6 н раствором едкого кали.

3. Стерилизующая  фильтрация концентрата калиевой  соли и упаривание под вакуумом  с бутиловым спиртом (2,5 объема) при температуре 16—26° и остаточном  давлении 5—10 мм рт. ст. Объем кубового остатка должен составлять не более 60—80% объема загруженного концентрата. Добавление бутанола к концентрату при упаривании под вакуумом связано с тем, что бутанол с водой образует смесь, кипящую при более низкой температуре по сравнению с температурой кипения воды. Отгонка воды проводится сравнительно в мягких условиях, вследствие чего возможность инактивации пенициллина уменьшается. После удаления воды и большей части бутилового спирта калиевая соль бензилпенициллина кристаллизуется,

4. Фильтрация  осадка калиевой соли бензилпенициллина на фильтрующей центрифуге и промывка осадка безводным бутиловым спиртом.

5. Гранулирование  полученной пасты и сушка калиевой  соли в вакуум-сушильных шкафах  при температуре 75—80° и остаточном  давлении 10—20 мм рт. ст. При этом получается калиевая соль бензилпенициллина в виде белого мелкокристаллического порошка с активностью содержанием бензилпенициллина порядка 95% и выходом 70% от количества антибиотика в нативном растворе.

3.3 Отходы производства

Основные отходы, образующиеся в результате выделения  и химической очистки антибиотиков, следующие: отработанные нативные растворы, водные маточные и промывные растворы, водные растворы кислот и щелочей после регенерации ионообменных смол, отработанный активированный уголь, кубовые остатки после регенерации растворителей. В этих отходах вредную долю составляют антибиотики и продукты их деструкции, а также органические растворители. Принципиальные задачи совершенствования технологии получения антибиотиков из нативных растворов с точки зрения сокращения отходов производства заключаются в повышении выхода целевых продуктов и тем самым снижении потерь антибиотика, снижении расходов сырья на стадиях и повышении эффективности регенерации органических растворителей.