Биотехнология целлюлаз

 Состав свекловичного жома. Состав жома характеризуется следующими данными (в %): белок 0,5, зола 0,3, клетчатка 1,3, гемицеллюлоза 1,2, пектиновые вещества и арабан 2,7, сахар 0,2.

Солодовые ростки.

Составная часть отходов пивоваренного производства, которая удаляется на росткоотбойных машинах после сушки солода. Ростки ячменного солода имеют малую объемную массу,
очень гигроскопичны, не подлежат длительному хранению; их
транспортирование связано с большими трудностями. Присутствие
алкалоида горденина и повышенное содержание аспарагина и золы
придает росткам горечь и специфический запах. Солодовые ростки содержат значительное количество азотистых веществ (25...30%), большая часть которых представлена азо­том аминокислоты и низшими пептидами. Они богаты безазоти­стыми экстрактивными веществами (30,..45%) и в меньших количе­ствах содержат клетчатку (9...12%), жир (1...2%), минеральные вещества  (6...7%),  а также органические  кислоты,  витамины
группы В, РР, Е. С, ферменты, стимуляторы роста (инозит и биотин) и гиббереллиноподобные вещества. Алкалоид горденин содержится в пределах 0.1...0.5% к массе сухих веществ.             
             Наличие  в  ростках  биологически  активных и  питательных
веществ явилось предпосылкой к использованию их в качестве
составной части питательных сред для выращивания микроорганиз­мов в спиртовом, дрожжевом, хлебопекарном производствах, в производствах кормовых антибиотиков (биомицина, террамицина), витаминов,
органических кислот, куль­тур плесневых грибов при изготовлении ферментных препаратов [4].

Лактоза

Лактоза (от лат. lactis — молоко) С12Н22О11 —углевод группы дисахаридов, содержится в молоке и молочных продуктах. Молекула лактозы состоит из остатков молекул глюкозы игалактозы. Выпускается в виде сухого порошка (белый кристаллический порошок без запаха )

Сырьем для получения является молочная сыворотка

  Растворима в воде, разбавленном этиловом спирте, пиридине, нерастворима в эфире и абсолютном спирте; при кислотном гидролизе расщепляется на галактозу и глюкозу.
Уникальные свойства лактозы обусловили ее широкое применение микробиологии, аналитической химии, пищевой промышленности и в производстве кормовых витаминов и ферментов.

Сульфат аммония.

Сульфат аммония (NH4)2SO4 — аммонийная соль серной кислоты, аммоний сернокислый.

Бесцветные кристаллы. Хорошо растворим в воде, нерастворим в ацетоне, этаноле и эфире.

Сульфат аммония содержит 21 % азота и 24 % серы. Это химически нейтральная кристаллическая соль белого цвета, хорошо растворимая в воде. Гигроскопичность её слабая, поэтому при длительном хранении не слёживается и сохраняет сыпучесть.

Азот и сера — важнейшие элементы питания сельскохозяйственных культур: они входят в состав белков и аминокислот.

Дигидрофосфат калия.

Формула : KH2PO4

Дигидроортофосфат калия (дигидрофосфат калия, монофосфат калия) — калиевая соль ортофосфорной кислоты; порошок белого цвета плотностью 2,34 г/см³.

При температуре 252,6° разлагается: KH2PO4 = KPO3 + H2O.

Растворимость в воде следующая: при 20 °C в 100 мл растворяется 22,6 г, при 90 °C — 83,5.

Однозамещённые ортофосфаты используются при производстве фосфорных удобрений, в фармацевтической промышленности. Кристаллы однозамещённых ортофосфатов — ценные сегнето- и пьезоэлектрические материалы.

Монофосфат калия используется в качестве фосфорного и калийного удобрений в растворённом виде для корневых и внекорневых подкормок.

Дигидрофосфат калия используется при приготовлении фосфатного буфера.

Сульфат магния.

  Сульфат магния (сернокислый магний) MgSO4 — бесцветные кристаллы плотностью 2, 66 г/см3.

      Растворимость в воде составляет 33, 7 г. в 100 г. воды при 20°С. Насыщенный раствор кипит при 108°С и содержит 75 гр. MgSO4 на100 гр. воды. Криогидратная точка — 3, 9°С (при 17, 0%  MgSO4 ).

      Сульфат магния образует кристаллогидраты с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 12 молекулами воды. При комнатной температуре из водных растворов кристаллизуется MgSO4 . 7H2O давно известной под названием горькой или английской соли, употребляемой как слабительное. Легко получается из магния и серной кислоты, выделяется при испарении морской воды и воды многих солёных источников. Кристаллы MgSO4 . 7H2O имеют орторомбическую (гр. оrthos прямой, правильный) решётку, а = 11, 94 Ǻ, b = 12, 03 Ǻ, с = 6,865 Ǻ плотностью 1, 68 г/см3.

 При температуре выше 48°С получается MgSO4 . 6H2O, который в интервале 87 — 92°С плавится с образованием метастабильныхMgSO4 . 5Н2О и MgSO4 . 4Н2О. Твёрдый MgSO4 . 4Н2О при 106°С переходит в MgSO4 . 3Н2О, а последний при 122 — 124°С — в MgSO4 .2Н2О, который при 161 — 169°С превращается в MgSO4 . Н2О. Из водных растворов стабильный моногидрат кристаллизуется выше 67, 5°С. Таким образом, между водой и  MgSO4 может существовать несколько определённых более или менее устойчивых равновесий.

      Обезвоживание моногидрата наблюдается при 320 — 330°С. Безводный MgSO4 при 1100 — 1200°С разлагается с заметной скоростью на MgO, SO2, и О2. В присутствии восстановителей (C, S, H2, CO, CH4) температура термического восстановления снижается. Известны основные соли сульфата магния: MgSO4 . 3MgO . 11H2O; MgSO4 . 5MgO . 8H2O.

      Одна из особенностей солей магния образовывать двойные соли с солями аммония. Если смешать насыщенные растворы MgSO4 и(NH4)2SO4, то осаждается кристаллическая двойная соль Mg(NH4)2(SO4)2 . 6H2O. Даже раствор NH4Cl даёт с MgSO4 эту соль. Её удельный вес 1, 72 г/см3.

Целлюлоза.

Целлюло́за (фр. cellulose от лат. cellula — «клетка, клетушка») — (C6H10O5)n[1], белое твердое вещество, нерастворимое в воде, молекула имеет линейное (полимерное) строение, структурная единица — остаток β-глюкозы [С6Н7О2(OH)3]n. Полисахарид, главная составная часть клеточных оболочек всех высших растений.

Целлюлоза — белое твердое, стойкое вещество, не разрушается при нагревании (до 200 °C), но является горючим веществом. Температура воспламенения 275 °С, температура самовоспламенения 420 °С (хлопковая целлюлоза). Не растворима в воде и слабых кислотах.

Целлюлоза представляет собой длинные нити, содержащие 300—10 000 остатков глюкозы, без боковых ответвлений. Эти нити соединены между собой множеством водородных связей, что придает целлюлозе большую механическую прочность, при сохранении эластичности.

Зарегистрирована в качестве пищевой добавки E460. [1,4]

6.Применение продукта в пищевых производствах

Ферментные препараты, способные разрушать целлюлозу находят широкое применение  в самых разных отраслях производства. Мировое производство целлюлаз составляет тысячи тонн. Использование целлюлаз позволяет применять безотходные технологии. Гидролиз целлюлозы дает глюкозу, которую можно использовать для производства пищевых и кормовых белковых препаратов, получать из нее спирт для энергетических целей.

Целлюлолитические ферменты с успехом применяют в самых различных производствах, где сырьем являются растительные материалы или отходы переработки растений.

Рассмотрим подробнее применение целлюлаз в пищевой промышленности. Данные ферменты применяются для экстракции и осветления соков и нектаров, получения каротина и пищевых красителей, размягчения сырья для виноделия, являются добавками для омолаживания ячменя при пивоварении, используются при приготовлении растворимого кофе.

Целлюлазы проводят гидролиз целлюлозы, гемицеллюлаза - гемицеллюлоз. Гидролиз пектиновых веществ протекает с участием пектолитических ферментов. Их применение дает возможность повышать выход продукта и осветлять плодово-ягодные соки.

Ферменты, осуществляющие гидролиз полисахаридов ( особенно амилазы), играют важную роль в хлебопечении, технологии сахаристых веществ, бродильных производств, получении спирта.

Целлюлазы и родственные им по составу ферменты благодаря высокой специфичности и мягким условиям деструкции могут быть использованы для выделения и анализа полисахаридов. В отличие от ферментативных методов химические методы значительно менее специфичны и требуют более жестких условий обработки

При обработке целлюлазой крахмальной мезги удается улучшить отделение крахмала и повысить его выход. Обработанные ею сушеные овощи в теплой воде быстро восстанавливают свою форму. Этим ферментом гидролизуют бобовые, в том числе бобы сои. Если целлюлазой обрабатывают морские водоросли, то при этом возрастает выход агар-агара. В результате действия пентозаназы может быть увеличен выход высококачественного крахмала из пшеницы. Гемицеллюлазы, эффективные при гидролизе природных слизей, гумми, камедей, предупреждают желатинирование кофейных концентратов, где пектиновые ферменты не влияют или действуют частично, расщепляя только пектины. [2]

7. Расчет теоретического выхода целевого продукта

Определим теоретический выход биомассы грибов в процессе ферментации:

,   где - молярная масса С-моль биомассы

- молярная масса С-моль субстрата

Поскольку в качестве субстрата служит свекловичный жом и солодовые ростки с добавлением источников азота, фосфора, и прочих минеральных веществ, то точный химический состав такого субстрата установить невозможно и для расчетов будем пользоваться формулой усредненной биомассы Стоутхамера для С-моль:СН1,8О0,5N0.2.

Таким образом, =121+11,8+16 0,5+140,2=24,6

Формула субстрата для С-моль имеет вид   С10Н22 СН2,2

=121+12,2=14,2

Тогда,

Для расчёта практического выхода необходимо рассчитать энергетический выход биомассы:

η= γs /γx

Для этого надо знать степень восстановленности  субстрата и продукта:

γs=4∙1+1∙2,2=6,2;  γx=4∙1+1,8∙1-,05∙2-0,2∙3= 4,2

η=6,2/4,2=1,47;

Уп=1,73∙1,47=2,55 [3]

Расчет стехиометрических коэффициентов.

Из источников углеродного питания известен точный химический состав лишь у лактозы. Для упрощения расчетов будем вести расчет именно по этому веществу.

Известно, что из 1 кг лактозы выход биомассы гриба Trichoderma viride составляет 0,4-0,5 кг, а выход продуктов метоболизма данного гриба (целлюлаз) 0,5 кг. [7]

М (С12Н22О11) =342 г/моль

Формула С-моля лактозы : СН1,83О0,98

Молекулярная масса С-моля =28,53 г/моль

Молекулярная масса целлюлазы (С3 Н16 О14) = 276 г/моль

Формула С-моля целлюлазы СН5,33 О4,66

Молекулярная масса С-моля =91,89 г/моль

Молекулрная масса с-моль биомассы = 24,6 г/моль

Упрощая, получаем

2,92; 20,3; 1,81 – стехиометрические коэффициенты уравнения биосинтеза целлюлаз.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1.       Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств /М.С.Мосичев, А.А.Складнев, В.Б Котов// - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. – 264 с.

2.       Грачева И. М. Технология ферментных препаратов /И.М.Грачёва//-М.:Агропромиздат, 1987.-335с.

3. Бирюков В. В. Основы промышленной биотехнолоии. / В. В. Бирюков//– М.: Колос, 2004. – 296 с.

4. Калунянц К. А., Голгер Л. И., Балашов В. Е. Оборудование микробиологических производств./ К. А. Калунянц, Л. И. Голгер, В. Е. Балашов // -  М.:Агропромиздат, 1987 – 796 с.

5. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. / В. Л. Кретович// - М.: Наука, 1986 – 323 с.

6. Патент РФ КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗЫ ПРИ ЕГО ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ МЕТОДОМ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА TRICHODERMA VIRIDE 44-11-62/3 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗЫ В ЭТОЙ СРЕДЕ. Васильев А.Е.; Огорельцев Б.Д.; Сафонов В.С.; Агафонов Е.Л.; Деветьярова Л.С. МПК C12N1/14, C12N9/42, C12N9/42, C12R1:885.

7. Лобанок А. Г., Бабицкая В. Г., Богдановская Ж. Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: Белок и другие ценные продукты./ А. Г. Лобанок, В. Г. Бабицкая, Ж. Н. Богдановская //— Мн.: Наука и техника, 1988.—261 с.

ГЛОССАРИЙ

Актиномицеты - (устар. лучистые грибки) — бактерии, имеющие способность к формированию на некоторых стадиях развития ветвящегося мицелия (некоторые исследователи, подчёркивая бактериальную природу актиномицетов, называют их аналог грибного мицелия тонкими нитями) диаметром 0,4—1,5 мкм, которая проявляется у них в оптимальных для существования условиях. Имеют грамположительный тип клеточной стенки и высокое (60—75 %) содержание ГЦ пар в ДНК.

Гликозидная связь (англ. Glycosidic bond) — это тип ковалентной связи, которая соединяет молекулу сахара с другой молекулой, часто с другим сахаром. Гликозидная связь образуется между полуацетальной группой сахара (или производной сахара) и гидроксильной группой органического соединения, например, спирта.

Глубинное культивирование – культивирование микроорганизмов на жидких питательных средах.

Изоферменты, или изоэнзимы — это различные по аминокислотной последовательности изоформы или изотипы одного и того же фермента, существующие в одном организме, но, как правило, в разных его клетках, тканях или органах.

Изоэлектрическая точка (pI) — кислотность среды (pH), при которой определённая молекула или поверхность не несёт электрического заряда. Амфотерные молекулы (цвиттер-ионы) содержат как положительные, так и отрицательные заряды, наличием которых определяется pH раствора. Заряд различных функциональных групп таких молекул может меняться в результате связывания или, наоборот, потери протонов H+. Величина изоэлектрической точки такой амфотерной молекулы определяется величинами констант диссоциации кислотной и осно́вной фракций