Биотехнология целлюлаз

1.      Общая характеристика продукта

ЦЕЛЛЮЛАЗЫ (целлюлолитические ферменты), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз 1,4-гликозидных связей в молекуле целлюлозы с образованием набора олигосахаридов различной степени полимеризации вплоть до мономера -глюкозы. 
Различают два осных типа целлюлаз: эндоглюканазы (1,4-глюкан-4-глюканогидролазы, эндо-1,4-глюканазы) и целлобиогидролазы (1,4--D-глюкан-4-целлобиогидролазы, экзоцеллобиогидролазы), отличающиеся по характеру действия на молекулы целлюлозы и, как правило, действующие совместно. 
Целлюлазы первого типа гидролизуют связи в молекуле целлюлозы и некоторых ее растворимых производных (карбоксиметил-, гидроксиэтилцеллюлоза и др.) неупорядоченным способом, образуя набор поли- и олигомерных фрагментов различной длины. Катализируют также реакцию трансгликозилирования (присоединение части расщепляемой молекулы поли- или олигосахарида к концевому невосстанавливающему ангидроглюкозному остатку другой поли- или олигомерной молекулы субстрата). 
Целлюлазы второго типа гидролизуют молекулы целлюлозы, образуя почти исключительно целлобиозу, которую они отщепляют с невосстанавливающего конца полисахарида (п - число звеньев цепи):

Другое отличие целлюлаз второго типа от эндоглюканаз - незначительное снижение ими вязкости растворов карбоксиметил- или гидроксиэтилцеллюлозы (при равной степени гидролизаполимера). 
Характерное свойство двух типов целлюлаз - наличие синергизма (взаимного усиления) при их совместном действии на высокоупорядоченные формы целлюлозы (хлопковое волокно, микрокристаллическая целлюлоза). 
Целлюлазы обнаружены у бактерий, актиномицетов, грибов, растений. Наличие целлюлаз у животных однозначно не доказано, однако многие насекомые, птицы, жвачные, грызуны содержат в пищеварительных органах микрофлору, образующую целлюлазы. Способность жвачных животных переваривать клетчатку обусловлена присутствием в их желудке (главным образом в рубце) симбиотических анаэробных микроорганизмов, выделяющих целлюлазы. 
Наиболее эффективные продуценты целлюлаз - грибы. Ферментные системы грибов содержат, как правило, множественные формы обеих форм целлюлаз, отличающиеся молекулярной массой, изоэлектрической точкой и содержанием ковалентно связанных углеводных остатков. Часть целлюлаз - истинные изоферменты, кодируемые самостоятельными генами, другие формы образуются при посттрансляционной модификации основных типов целлюлаз. 
Наиболее изученным продуцентом целлюлаз, имеющим важное прикладное значение, является почвенный грибок Trichoderma viride (reesei). Он секретирует по меньшей мере 2изофермента целлобиогидролазы с молекулярными массами 65 и 55 тыс., рI 3,9-4,2 и 5,9-6,5 соотвенно, а также 2 изофермента эндоглюканазы с рI 4,7 и 5,4. Определена первичная структура всех этих ферментов. Оптимальное каталитическое действие целлюлаз большинства грибов проявляется при рН 4-5. 
Среди анаэробных бактерий наиболее известный продуцент целлюлаз - Clostridium thennocellum. Структура целлюлаз этих бактерий существенно отличается от целлюлаз грибов. Этот микроорганизм секретирует крупные надмолекулярные образования, в составе которых обнаруживается не менее 14 различных белков, в т. ч. молекулы целлюлазы, - так называемые целлюлосомы (общая молекулярная масса более 2 млн.). Сходные образования обнаруживаются и у некоторых других анаэробных бактерий, в том числе находящихся в желудке жвачных животных. 
В составе целлюлосом обнаружены по крайней мере 4 изофермента целлюлаз первого типа и 1 - второго. Для всех эндоглюканаз целлюлосомы определена первичная структура, а для одной из них - также пространственная. Оптимальная каталитическая  активность бактериальных ферментов при рН ок. 7. 
Наиболее известный ингибитор целлюлаз, в особенности для целлюлаз второго типа,- целлобиоза. 
В первичную структуру многих целлюлаз входит так называемый сорбционный домен - фрагмент полипептидной цепи, определяющий связывание молекулы фермента с поверхностью целлюлозы. У различных целлюлаз он локализован на С- или на N-конце молекулы и связан переходной областью с. Последний, при протеолитическом отщеплении сорбционного домена, способен катализировать гидролиз производных целлюлозы в растворе, но не активен по отношению к нерастворимым субстратам. 
Целлюлазы применяют в производстве соков и вин (для их осветления), комбикормов (для их лучшего усвоения), а также для получения высококачественной бумаги. 
Мировое произ-во целлюлаз составляет тысячи тонн (в числе основных производителей - Япония, Дания, Финляндия, Россия). [1,2,4]

2.      Обзор возможных способов получения продукта

Целлюлазы синтезируются исключительно микроорганизмами (бактериями, микроскопическими грибами и актиномицетами). Целлюлолитические микроорганизмы преимущественно разрушают целлюлозу и не используют другие компоненты питательных сред в качестве источников энергии. 

В качестве возможных продуцентов целлюлаз рассматриваются многие микроорганизмы. Но выделять в среду ферменты в большом количестве способны только микроскопические грибы. Микроскопические грибы – наиболее вероятные продуценты целлюлаз с использованием агроотходов, так агроотходы по составу наиболее схожи с их природными субстратами. Также отмечается, что культивирование грибных продуцентов является наименее затратным процессом при промышленном производстве целлюлаз. 

Наиболее полно изучен продуцент Trichoderma reesei, способный разрушать нативную целлюлозу. Однако этот штамм, несмотря на внеклеточную продукцию фермента, производит не самый эффективный целлюлазный комплекс. В результате 40 летних обширных поисков было найдено около 60 продуцентов целлюлаз. Грибы, такие как Humicola, Aspergillus и Penicillium, бактерии, такие как Cellulomonas, Pseudomonads и актиномицеты – Streptomyces применяются для производства целлюлазы. Penicillium, Aspergillus и Humicola гидролизуют нативную клетчатку.

В коммерческом производстве целлюлаз в настоящий момент наиболее распространенным методом получения является глубинное культивирование. Однако поверхностное культивирование обеспечивает более оптимальные условия для роста аэробных микроскопических грибов. 

Твердофазное культивирование, по мнению многих авторов, перспективная технология для производства целлюлаз, так как она менее затратна и использует доступные источники клетчатки. Подсчитано, что при производстве 1 килограмма целлюлазы c помощью Clostridium thermocellum, при глубинном культивировании затрачивается 40,36 долларов США, тогда как при поверхностном – 15,67 долларов США (в ценах 2010 года). Однако существуют ограничения в применении твердофазной ферментации: длительное время культивирования и низкая продуктивность. 

При промышленном производстве целлюлаз применяют традиционную схему выделения ферментов: экстракция водой водорастворимой части культуры; стабилизация целлюлаз в растворе некоторыми солями; осаждение целлюлаз или их частичное фракционирование органическими растворителями; высушивание влажных осадков.

Агропромышленные отходы давно применяются в качестве дополнительного источника клетчатки и как субстраты для роста микроорганизмов-продуцентов целлюлаз. Углеводными источниками в промышленном производстве целлюлаз являются: солома, отходы обмолота злаковых культур, пшеничные и рисовые отруби, тростниковая меласса и отходы бумажной промышленности. В отечественной ферментной промышленности для производства целлюлаз применяют в основном пшеничные отруби. Наряду с отрубями в составы сред вводятся солодовые ростки, которые богаты витаминами группы В, фосфором, клетчаткой, легкоусвояемыми редуцирующими веществами и аминокислотами. В состав среды также вводят рисовую, овсяную или ячменную шелуху, свекловичный жом.

В качестве примера приведем технологию получения целлюлазного препарата целловиридин ГЗх

Рекомендуемая регламентная среда для культивирования, %:

Свекловичный жом - 2,9;

Солодовые ростки - 1,4;

Лактоза - 0,3;

Сульфат аммония - 0,7;

Дигидрофосфат калия - 1,0;

Сульфат магния - 0,05;

Целлюлоза - 0,9.

Водородный показатель среды 5,5 pH. Культивирование проводят в непрерывном режиме семь суток. Удельная активность фермента в культуральной жидкости до 30 ед/мл. Объем культуральной жидкости 32 м3 при коэффициенте загрузки 0,6. Недостатком данного способа для получения целловиридина в промышленных условиях на ферментерах объемом 63 м3 является то, что в качестве источника углерода в питательной среде применяют свекловичный жом. Он даже после дробления имеет пористую структуру, разбухает в воде и всплывает, что приводит к образованию обильной пены. Это является причиной образования заторов в технологических трубопроводах. Для устранения затора технологическую операцию необходимо прерывать. Кроме этого, подобное обстоятельство отрицательно сказывается на работе технологического оборудования. 

Все это ведет к значительным механическим потерям, как питательной среды, так и культуральной жидкости и, следовательно, к низкому выходу конечного продукта. Снижение выхода обуславливается главным образом низкой технологичностью питательной среды, связанной с негомогенностью ее состава из-за использования свекловичного жома в качестве источника углерода.

Проблема увеличения  выхода процесса получения ферментного препарата целловиридина при его промышленном производстве  может быть решена путем применения более технологичной питательной среды, в которой углеводные компоненты не образуют заторов или пены. Хорошо подвергаются термической стерилизации на установке непрерывной стерилизации - УНС-20. Это исключит причины механических потерь. Поставленная цель достигается тем, что предлагается способ получения целлюлазы с ферментационной средой, где в качестве источника углерода вместо свекловичного жома используют крахмал кукурузный и отруби пшеничные, гидролизованные до доступных сахаров ферментными препаратами глюкаваморином ГЗх и амилосубтилином ГЗх, что придает ей новое качество - гомогенность. При этом продуктивность процесса биосинтеза целлюлазы должна быть не ниже 20-25 ед/мл. Эта цель достигается тем, что предлагается способ получения целлюлазы с ферментационной средой, где в качестве источника углерода вместо свекловичного жома используют крахмал кукурузный и отруби пшеничные, гидролизованные до доступных сахаров ферментными препаратами глюкаваморином ГЗх и амилосубтилином ГЗх. При этом процесс ферментации проводят при дискретном внесении активирующей добавки - раствора лактозы в течение всего биосинтеза целлюлазы в культуральной жидкости до 27 ед/мл. Это на 15% выше регламентной характеристики.
Сущность изобретения заключается в оптимальном соотношении компонентов питательной среды и дозировке раствора лактозы в процессе ферментации. Предлагается питательная среда для получения фермента целлюлазы, содержащая дигидрофосфат калия, сульфат магния, целлюлозу, лактозу и воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит хлорид кальция, гидрофосфат аммония, дрожжи кормовые и ферментативные гидролизаты пшеничных отрубей и кукурузного крахмала при следующем соотношении компонентов, %:
Ферментативный гидролизат крахмала кукурузного - 1,5
Ферментативный гидролизат отрубей пшеничных - 3,0
Хлорид кальция - 0,05
Гидрофосфат аммония - 0,6
Дигидрофосфат калия - 0,3
Дрожжи кормовые - 0,15
Сульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,5
Лактоза - 0,5
Вода водопроводная - Остальное
Из расчета на 1 кг крахмала добавляют 3000 ед. активности амилазы и 6000 ед. активности глюкоамилазы. На 1 г целлюлозы добавляют 12 ед. активности целлюлазы (отдельно готовят подпитку - раствор лактозы из расчета 0,5% на весь процесс ферментации). Раствор лактозы вносят дискретными порциями. Эта питательная среда гомогенна по своему составу и обладает высокой технологичностью при производстве целлюлазы на промышленных ферментерах. Практически не образует заторов, что значительно снижает механические потери. Дискретная дозировка раствора лактозы позволяет достичь нужной продуктивности процесса биосинтеза целлюлазы, а именно 27 ед/мл, что выше продуктивности среды со свекловичным жомом. Это приводит к увеличению выхода при промышленном производстве целловиридина ГЗх на 24%. Технологический процесс при этом становится более предсказуемым и воспроизводимым.
Использование очищенной целлюлозы, для промышленных процессов получения целлюлаз, лишено многих недостатков, но является затратным. Лактоза, целлобиоза, гентобиоза, являются индукторами биосинтеза целлюлозы, но только применение лактозы экономически целесообразно. Исследователи разных стран пытаются найти агросырье, эффективно заменяющее компоненты питательной среды. Научные центры, занимающиеся данной проблемой, расположены в Индии, Нигерии, Бангладеш и Китае. Получены многообещающие результаты, но многие данные противоречивы. При рассмотрении технологий можно выделить несколько важных аспектов. 

1)              Сырье для культивирования необходимо подготавливать (измельчать, проводить кислотный или щелочной гидролиз). 

2)              Выбор метода и условий культивирования влияет на ферментный состав целлюлаз. Например, при глубинном культивировании выход эндоглюконаз выше чем при поверхностном. 

3)              Выбор штамма-продуцента определяет время культивирование (от 1 до 22 дней), также влияет на необходимость добавлять экзогенные источники углеводов, азота, минеральных солей.

Для характеристики ферментного состава целлюлаз принято измерять три активности: FPA (Filter Paper Activity), CMC (Carboxymethyl cellulаse), целлобиозную или β-глюкозидазную. Хотя многие авторы измеряют суммарную целлюлазную активность, или активность только определенного фермента. [1-5]

3.      Обоснование целесообразности использования биотехнологических приемов в производстве данного продукта

Целесообразность получения целлюлаз биотехнологическим методом ясна из предыдущего пункта: альтернативных способов получения данных ферментов в настоящее время  не существует, так как они являются весьма специфичными и уникальными природными веществами.

Более того, если предположить, что будет найден химический (или иной) способ производства данного продукта, то наверняка окажется более затратным, поскольку только в процессах биотехнологии можно использовать дешевые отходы сельского хозяйства и промышленности. Биотехнологические процессы по сравнению с химическими обычно более экологичны, имеют меньше вредных отходов, близки к протекающим в природе естественным процессам, протекают при относительно невысоких температурах и давлениях. Как правило, технология и аппаратура в биотехнологических производствах более просты и дёшевы. [3]

4.      Описание технологических стадий и режимов производства продукта

Рассмотрим процесс культивирования низшего гриба Trichoderma viride 44-11-62/3.
Питательную среду на 63 м3 ферментер (стандартный) приготовляют исходя из следующего состава, %:

Свекловичный жом - 2,9
Солодовые ростки - 1,4
Лактоза - 0,3
Сульфат аммония - 0,7
Дигидрофосфат калия - 1,0
Cульфат магния - 0,05
Целлюлоза - 0,9
Водородный показатель среды 5,5 pH.
Отдельно готовят углеводные компоненты: свекловичный жом, солодовые ростки, целлюлозу, – их измельчают молотковой дробилкой и отдельно солевые компоненты: сульфат аммония, лактозу, дигидрофосфат калия, сульфат магния – они подвергаются растворению.

Затем все компоненты стерилизуют острым паром в установке непрерывной стерилизации при температуре 124-130oC поочередно, подавая в смеситель. Из смесителя по технологическим линиям готовую среду подают в ферментер. Куда затем вносят посевной материал низшего гриба Trichoderma viride 44-11-62/3. Культивирование проводят семь суток при температуре (30±1)oC. Стерильный воздух подают, исходя из расчета 0,3 объема/ч на 1 объем культуральной жидкости первые 12 ч роста культуры, 1 объем/ч на 1 объем культуральной жидкости с 12 до 72 ч, с 72 ч 0,5 объема/ч на 1 объем культуральной жидкости. Избыточное давление 0,05 МПа. Скорость вращения Скорость вращения мешалки 177 об/мин. Культивирование проводят без внесения подпиток в процессе ферментации. На 5-7 сутки среда имеет значение водородного показателя 3 ед.pH.
Полученную культуральную жидкость, обладающую целлюлазной активностью, по технологическим трубопроводам Подают на распылительную сушилку СРЦ-100.
Расчетный коэффициент загрузки ферментера 0,6. Получено 30 3 культуральной жидкости с удельной ферментативной активностью по целлюлазе 23 ед/мл. После сушки получено 360 кг целловиридина ГЗх с ферментативной активностью 330 ед/г. Выход процесса составляет 17,2%. [5]

Эскизная схема процесса получения ферментного препарата целловиридина Г3х представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Эскизная схема процесса получения ферментного препарата целловиридина Г3х

Принципиальная технологическая схема получения ферментного препарата целловиридин Г3х методом глубинного культивирования представлена на рисунке 2.

Рис.2 Принципиальная технологическая схема получения ферментного препарата целловиридин Г3х методом глубинного культивирования
1 – смеситель питательной среды; 2 – колонна для непрерывной стерилизации потока питательной среды острым паром; 3 - теплообменник – выдерживатель; 4 – теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 – инокуляторы (посевные аппараты); 6 – индивидуальный фильтр для очистки воздуха, подаваемого в инокулятор; 7 – реактор – ферментер; 8,9 – насосы; 10 – масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 – компрессор; 12- головной фильтр для очистки воздуха 
 

5.      Химический состав и физико-химические свойства сырья и полуфабрикатов

Питательная среда для получения целлюлаз состоит из следующих компонентов: свекловичный жом, солодовые ростки, лактоза, сульфат аммония, дигидрофосфат калия, сульфат магния, целлюлоза
Свекловичный жом

Жом представляет собой высоложенную свекловичную стружку, содержащую около 6—7,5% сухих веществ, в том числе 0,2—0,4% сахара. Выход жома при работе на периодической диффузионной батарее составляет 90% по весу переработанной сахарной свеклы, а на непрерывно действующей батарее — 70—80% по весу переработанной сахарной свеклы.