Автор: Пользователь скрыл имя, 31 Октября 2011 в 20:50, курсовая работа
Люминесценция - излучение, которое является избытком над тепловым излучением тела и продолжается в течение времени, значительно превышающего период световых колебаний. Первая часть определения отделяет люминесценцию от теплового равновесного излучения и показывает, что понятие люминесценция применяется только к совокупности атомов (молекул), находящиеся в состоянии, близком к равновесному, так как при сильном отклонении от равновесного состояния говорить о тепловом излучении или люминесценции не имеет смысла. Тепловое излучение в видимой области спектра заметно только при температуре тела в несколько сотен или тысяч градусов, тогда как люминесцировать оно может при любой температуре. Люминесценцию поэтому часто называется холодным свечением.
Раздел I. Теоретическая часть
1.1. Явление люминесценции. Общее описание.
1.2. Молоко натуральное коровье. Технические требования
1.3. Люминисцентный анализ. Количественный и качественный анализ. Виды люминесцентного анализа.
Раздел II. Экспериментальная часть.
Прибор для люминесцентного анализа.
Раздел III. Практическая часть.
3.1.Методика определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в коровьем молоке
Вывод
растворении соматических клеток, белка и жира молока BPN-реагентом (растворитель соматических клеток, белка и жира молока);
фильтровании полученного раствора молока через бактериальный мембранный фильтр;
растворении отфильтрованных микроорганизмов диметилсульфоксидом;
измерении люминесценции полученного раствора, расчете молярной концентрации аденозина-5трифосфата (АТФ) микроорганизмов и выражении ее значения в колониеобразующих единицах (КОЕ/см3)молока.
3.1.1. Средства измерений и вспомогательные устройства
Флуориметр ЕФ-3М обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 330 до600нм.
Люминометрическая кювета полистирольная диаметром 10мм, вместимостью 0,35см3, дно которой выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0,45 мкм.
Штатив для люминометрических кювет.
Шприц медицинский вместимостью 5см3 по ГОСТ 22967, ГОСТ 24861.
Наконечник резиновый к медицинскому шприцу.
Колба вместимостью 5см3, 100см3, 1дм3.
Пипетки автоматические, позволяющие дозировать объемы: 0,02; 0,05; 2см3.
Наконечники к автоматическим пипеткам стерильные.
Термометр стеклянный жидкостной, диапазон измерения 0оС - 100оС, цена деления шкалы 1°С.
Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
Шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (165 ± 5)°С.
Стерилизатор воздушный медицинский или стерилизатор паровой медицинский, позволяющие поддерживать температуру (121 ± 2)°С.
Баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 ± 1)°С.
Перегонная установка.
Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0,02мг.
Установка для получения денонсированной воды.
Пипетка стеклянная номинальной вместимостью 50см3.
Эксикатор по ГОСТ 23932.
Вакуумметр по ГОСТ 2405.
3.1.2. Реактивы и материалы
АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ, чистый сухой, содержащий люциферзу светляков, Д-люцеферин, соль магния, компоненты буферной системы, стабилизаторы.
Вода деионизированная с электропроводимостью не белее 0,1мкСм.
Вода дистиллированная.
АТФ сухой с содержанием основного вещества не менее 99 % .
BPN-реагент чистый сухой с массовой долей неионного детергента не более 5 %, содержащий компоненты буферной системы и комплекс протеза.
Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии, чистый, с массовой долей неионного детергента не более 1 %.
Диметилсульфоксид.
Кислота соляная.
Аргон по ГОСТ 10157.
Фильтровальная бумага по ГОСТ 12026 или фильтровальный картон по ГОСТ 12290.
Бумага мешочная по ГОСТ 2228.
Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652.
3.1.3. Подготовка к измерениям
3.1.3.1.Приготовление водного раствора с массовой долей соляной кислоты от 1 % до 2 %
В мерную колбу вместимостью 1дм3, наливают от 100 до 200см3 дистиллированной воды и доливают пипеткой 50см3 соляной кислоты.
3.1.3.2. Подготовка посуды, инструментов и материалов
Лабораторную посуду, инструменты и материалы, стерилизуют в соответствии с ГОСТ 26668. Колбу для отбора молока вместимостью 100см3 кипятят в водном растворе соляной кислоты в течение 15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Затем колбу стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160 5)оС в течение 2 ч с последующим охлаждением в эксикаторе либо в стерилизаторе при температуре (121 2)оС в течение (30 ± 1) мин с последующим охлаждением в эксикаторе.
3.1.3.3. Очистка диметилсульфоксида с помощью перегонки
Диметилсульфоксид перегоняют в потоке аргона при температуре (72,0 ± 0,2) оС и остаточном давлении 15 мм рт. ст. Для шлифов перегонной установки использование смазки не допускается. Перегнанный диметилсульфоксид хранят в стеклянной посуде без доступа света в течение 30 дней при температуре не выше 4 оС.
3.1.3.4. Подготовка раствора АТФ-реагента [5]
В упаковку с сухим АТФ-реагентом автоматической пипеткой, позволяющей дозировать 1 см3, вносят деионизированную воду в объеме, указанном на этикетке упаковки, и осторожно перемешивают покачиванием. Если для испытания используют несколько упаковок с сухим АТФ-реагентом, то их содержимое после добавления деионизированной воды объединяют в одну упаковку с помощью автоматической пипетки. Перед использованием раствор АТФ-реагента выдерживают от 15 до 30 мин. Полученный раствор используют в течение 6 ч.
3.1.3.5. Приготовление контрольного образца АТФ с молярной концентрацией (С1) —1∙10-11моль/см3
Взвешивают (0,2755 ± 0,0001)г АТФ, растворяют его деионизированной водой в мерной колбе вместимостью 5см3. 0,5см3 водного раствора АТФ вносят в мерную колбу вместимостью 5см3 и доводят объем раствора до метки диметилсульфоксидом. Данную процедуру повторяют еще девять раз, последовательно растворяя 0,5см3 вновь получаемых растворов диметилсульфоксидом в мерных колбах вместимостью 5см3.
3.1.3.6 . Измерение люминесценции и контрольного образца АТФ
Люминометрическую кювету помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и последовательно вносят в нее 0,02см3 контрольного образца АТФ и 0,05см3 деионизированной воды, а также 0,05см3 раствора АТФ-реагента. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки вместимостью 0,05см3 и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию l1.
Процедуру измерения люминесценции контрольного образца АТФ проводят дважды. АТФ-реагент считают пригодным для проведения испытаний, если для среднеарифметического значения двух результатов наблюдений люминесценции выполняется условие: l1 500 усл. ед.
3.1.3.7. Подготовка пробы молока [5]
Из объединенной пробы молока отбирают 250см3 молока, фильтруют его через иглопробивную ткань. Предварительно ткань стерилизуют при температуре (1212) оС в течение (30±1) мин. охлаждают в эксикаторе до температуры (20±2)оС. Предварительно поверхность установки для фильтрования молока обрабатывают этиловым спиртом и высушивают.
3.1.3.8. Проведение измерений [5]
3.1.3.9. Отбирают 50см3 отфильтрованного молока и помещают в колбу вместимостью 100см3. Молоко подогревают до температуры (20 ± 2)°С и перемешивают.
3.1.3.10. Автоматической пипеткой отбирают 1см3 молока, вносят его в упаковку c BPN-peaгентом и перемешивают содержимое. Упаковку выдерживают в водяной бане при (45 ± 1) оС в течение 10 мин.
3.1.3.11. Люминометрическую кювету устанавливают на стопку из трех-пяти полосок фильтровальной бумаги или на одну полоску фильтровального картона, помещенных в штатив для люминометрических кювет. В люминометрическую кювету автоматической пипеткой вместимостью 0,2см3 вносят 0,2см3 раствора и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление воздуха с помощью шприца с резиновым наконечником. Стопку фильтровальной бумаги или полоску фильтровального картона в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
Если фильтрование затруднено, то процедуру по 3.1.3.10. повторяют с увеличением времени выдерживания упаковки в водяной бане до 20 мин.
3.1.3.12. В люминометрическую кювету автоматической пипеткой вместимостью 0,2см3 вносят 0,2см3 промывочного раствора и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Стопку фильтровальной бумаги (или полоску фильтровального картона) в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
3.1.3.13. Подготовленную люминометрическую кювету помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и автоматической пипеткой вместимостью 0,02см3 вносят в нее 0,02см3 диметилсульфоксида. Через 1 мин автоматической пипеткой вместимостью 0,05см3 в люминометрическую кювету вносят последовательно 0,05см3 денонсированной воды и 0,05см3 раствора АТФ-реагента. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию анализируемой пробы l2.
3.2. Обработка результатов
3.2.1. За результат измерений люминесценции контрольного образца принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений l1, если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.
3.2.2. За результат измерений люминесценции анализируемой пробы принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений l2, если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.
3.2.3 Молярную концентрацию АТФ С2 моль/см3, в анализируемой пробе рассчитывают по формуле:
С2=0,1 С1 (l2)( l1), (3)
где 0,1 – коэффициент, учитывающий коефициент концентрирование микроорганизмов в люминометрической кювете при фильтровании раствора;
С1 – молярная концентрация АТФ в контрольном образце;
l1 – среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции контрольного образца АТФ;
l2 – среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции анализируемой пробы.
3.2.4 Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют по таблице 3.[6]
Таблица 3.
Вывод
В ходе курсовой работы мною был изучено понятие люминесценция, виды люминесцентно анализа.
В работе был описан принцип работы прибора для люминесцентного анализа. Также в работе был описан люминесцентный метод определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Сама методика состоит из определенных этапов:
очистка диметилсульфоксида;
подготовка раствора АТФ-реагента;
приготовление контрольного образца АТФ;
измерение люминесценции и контрольного образца АТФ;
подготовка пробы молока;
проведение измерений.
После проведения измерений