Шпаргалка по "Микробиологии"

Серологический метод

(в д-ке инфекц. заболеваний)- совокупность пробирочных реакций,  основанных на Аг -Ат-взаимодействии(см.) и направленных на выявление в сыворотке крови и др. жидкостях организма Ат к Аг возбудителей инфекц. болезней.

Серодиагностику проводят с помощью набора специфических  антигенов, выпускаемых коммерческими  фирмами. По результатам серодиагностических  реакций судят о динамике накопления антител в процессе заболевания, о напряженности постинфекционного  либо поствакцинального иммунитета.

Сероидентификацию микробных культур проводят для  определения их вида, серовара с  помощью наборов специфических  антисывороток, также выпускаемых  коммерческими фирмами.

 

76.

Реакции преципитации (РП) [от лат. praecipito, осаждать] предложены Краусом (1897) и основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с AT. РП ставят в специальных узких пробирках. В качестве реагентов используют гипериммунные преципитирующие сыворотки с высокими титрами AT к гомологичным Аг. При постановке РП разводят не сыворотку, а Аг. Реакционная среда должна содержать электролиты (физиологический раствор) и иметь нейтральный рН. РП позволяет быстро (в течение нескольких секунд) выявлять незначительные количества Аг. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси Аг. Метод имеет несколько разновидностей (рис. 10-16).

Реакция кольцепреципитации

На слой антисыворотки  наслаивают жидкость, содержащую растворимый  Аг, и через несколько секунд наблюдают  образование кольца преципитата(рис. 10-16, А). Широкое распространение получила реакция термопреципитации Асколи на Аг возбудителя сибирской язвы, использующая Аг, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья.

 

Реакцией кольцепреципитации также выявляют AT к бруцеллам в молоке (кольцевая проба Банга).

Реакция микропреципитации

Для выявления низких титров AT (например, при сенсибилизации к  ЛС) применяют нефелометрическую  реакцию микропреципитации (или  реакция помутнения), предложенная Уанье (1955). При её постановке в исследуемую  сыворотку крови вносят Аг в убывающей  концентрации; при отсутствии AT разведение сыворотки крови Аг уменьшает  её оптическую плотность. Однако в присутствии  минимальных количеств AT образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды.

 

77.

 

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), "склеенных" антителами.

РА  используют для:

• Определения возбудителя, выделенного от больного животного
• Определения антител в сыворотке крови больного животного

Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1 : 20) добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного животного. Образуется хлопьевидный осадок.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного животного. К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.

 

78.

Непрямая  гемагглютинация

 

В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.	Антигенный эритроцитарный диагностикум
Эритроциты (или частицы  латекса) с адсорбированными на них  антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови, что  вызывает склеивание и выпадение  эритроцитов на дно пробирки или  ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки.	Реакция непрямой (пассивной) агглютинации
РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.
Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикум - эритроциты, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА).

 

 

79.

 

Реакция торможения гемагглютинации — серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими видами вирусов (аденовирусами, арбовирусами, некоторыми энтеровирусами, вирусами гриппа и парагриппа, кори, реовирусами). Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов.

В последнее время реакция широко используется в лабораториях клинической  вирусологии для определения  титров специфических антител к  тем или иным вирусам, а также  для серологической идентификации  и типирования изолятов вирусов  из клинического материала от больных. Используют несколько ограничено в  силу наличия в сыворотке крови  людей неспецифических ингибиторов  вирусов, а также естественных антител  — агглютининов.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Несмотря на своё название, принцип реакции во многом аналогичен РН вирусов, так как основан на способности AT связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

 

80.

Реакция связывания комплемента (РСК) предложена Ж. Борде и О. Жангу. Реакция включает две фазы .

В фазе I (специфической) реакции связывания комплемента  ( РСК ) искомый Аг (или AT) реагирует с диагностической антисывороткой (или Аг-диагностикумом) и комплементом. Образующийся комплекс Аг-АТ связывает комплемент.

В фазе II (индикаторной) реакции связывания комплемента  ( РСК ) определяют наличие свободного комплемента внесением в реакционную среду гемолитической системы — эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей AT к ним. Если Аг и AT не соответствуют друг другу и не образуют иммунных комплексов, то связывания комплемента не происходит. В этом . случае свободный комплемент взаимодействует с компонентами гемолитической системы, фиксируясь на комплексе эритроцит-антиэритроцита рное AT. Следствие этого — гемолиз индикаторных клеток (феномен «лаковой крови») — реакцию считают отрицательной.

Если в фазе I реакции связывания комплемента  ( РСК ) AT и Аг соответствуют друг другу, то образующиеся иммунные комплексы связывают комплемент, разрушения эритроцитов после внесения гемолитической системы не наблюдают и реакцию считают положительной. Основные недостатки РСК: сложность (включает 5 компонентов), лабильность некоторых компонентов [их необходимо готовить прямо перед постановкой реакции (комплемент) либо за несколько суток (эритроциты барана)] и возможные антикомплементарные свойства у сывороток и Аг. Тем не менее РСК применяют в диагностике многих заболеваний, например при диагностике сифилиса (реакция Вассерманна).

 

81.

 

Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности AT связывать различные возбудители или их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои биологические свойства (иными словами, AT нейтрализуют возбудителей). На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В определённой степени к ним же относят реакции торможения вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.

Реакции нейтрализации  вирусов

В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют AT, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием  культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением лабораторному  животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации  указывает выживание животного  либо отсутствие гибели клеток в культурах.

 

Реакции нейтрализации  токсинов

Реакции нейтрализации  токсинов применяется для идентификации бактериальных экзотоксинов по видовой и типовой их принадлежности, а также для определения содержания антитоксинов в исследуемой сыворотке. Принцип основан на способности антитоксинов связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических AT их смесь вводят лабораторным животным. При соответствии типа токсина и антисыворотки гибели животных не наблюдают. Нейтрализацию токсинов in vitro определяют в реакции флоккуляции. Для определения антитоксического иммунитета у человека часто применяют кожные пробы (например, пробу Шика).

 

 

82-83.

Реакции с применением меченых  антител ( AT ) и антигенов ( Аг ). Метод радиоиммунного анализа ( РИА ).

Реакции с использованием меченых AT и Аг составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и AT в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители-флюорохромы и изотопы.

Метод радиоиммунного анализа ( РИА )

В основе метода радиоиммунного анализа (РИА) — маркирование радионуклидом Аг или AT, вступающих в реакцию. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках импульсов. Наибольшее распространение получил радиоиммунный анализ на твёрдой фазе (твердофазный РИА) с использованием меченых Аг или AT, сорбированных в лунках полистироловых панелей. РИА применяют для выявления микробных Аг, различных гормонов, ферментов и т.д. Широкое распространение метода ограничивает необходимость создания условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклидами.

ИФА. Иммуноферментный анализ ( ифа ). Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Схема, методика иммуноферментного анализа ( ифа ).

Метод иммуноферментного  анализа (ИФА) во многом напоминает РИА, но включает использование коммерческих реагентов — Аг или AT, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды в жёлто-коричневый (при использовании псроксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).

По сравнению с классическими  методами выявления Аг, иммуноферментный анализ ( ифа ) позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие Аг с AT в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия — агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность — обычно достаточно присутствия Аг в концентрации I нг/мл. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики.

Наибольшее распространение получил  гетерогенный иммуноферментный анализ ( ифа ) на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Для этого коммерческие моноклональные AT или Аг фиксируют на лунках пластиковых панелей, куда затем вносят исследуемый материал (содержащий Аг или AT). Основные варианты твердофазного иммуноферментный анализ ( ифа ) представлены на рис. 10-19. На практике ИФА широко применяют для выявления Аг Chlamydia trachomatis в мазках из мочеиспускательного канала и влагалища, стрептококков группы А в мазках из зева и токсина Clostridium difficile в фекалиях. Метод позволяет не только выявлять AT, но и определять их принадлежность к различным классам lg, например выявлять IgM к Аг Mycoplasma pneumoniae.

Иммуноблотинг. Техника иммуноблотинга. Методика выполнения иммуноблотинга. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Иммуноблотинг [от англ. blot, пятно] — метод идентификации Аг (или AT) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации Аг ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют.

После отмывания несвязавшихся AT (при  их наличии) проводят ИФА — на плёнку наносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка к lg на носителе появляются окрашенные пятна (рис. 10-20).

: Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) разработана А. Кунсом (1941) и основана на применении AT, меченных флюорохромными красителями. Такие AT, связывая различные Аг, вызывают свечение иммунных комплексов в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. На практике применяют несколько вариантов РИФ.

 

84.

Шика реакция

внутрикожная проба с  дифтерийным токсином, применяемая  для установления противодифтерийного  иммунитета. Для постановки Ш.р. внутрь кожи ладонной поверхности предплечья туберкулиновым шприцем вводят 0,2 мл стандартного дифтерийного токсина, содержащего 1/64 ДЛМ для морской свинки. Результат учитывают через 72 - 96 ч. У людей, не имеющих Ат против токсина или имеющих их мало, на месте введения образуются краснота и инфильтрат (положительная реакция); у людей, в с-ке к-рых содержатся антитоксические Ат в концентрации 1 /30 АЕ и больше, инфильтрат не развивается или он меньше 1 см (отрицательная реакция). Результаты Ш.р. используют для оценки коллективного иммунитета и проведения профилактических прививок. В настоящее время с этой целью применяют РПГА с эритроцитарным диагностикумом.