Санитарное значение и диагностика Эшерихиоза. Энтерогеморрагические кишечные палочки Е.сoli О157 : Н7

Посевы  инкубируют при 37 °С в течение 18-24 часов.

                             Второй день исследований.

1) Среди  выросших колоний на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агаре отбирают неокрашенные сорбитолнегативные колонии, характерные для E.coli O157:Н7,и засевают их на отдельные сектора в чашки Петри с питательным агаром. При наличии большого количества неокрашенных колоний необходимо отсеять не менее 20 изолятов (по 10 на чашку).

Посевы  выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

2) С помощью  иммунохроматографических экспресс– тестов определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или иммунохроматографических экспресс–тестов для определения энтерогеморрагических E.coli проводят анализ культур, выросших на твёрдых питательных средах. Подготовку образца для анализа и постановку иммунохроматографических экспресс тестов проводят в соответствии с инструкцией по их применению (Изложена в МУК4.2.2963-11 вПриложение 6).

3) С помощью  мультиплексной ПЦР (набор «ТЭК-O157»  или аналоги), предназначенной для  индикации клеток E.coli O157:Н7/O157:H^- по наличию в них генов rfb, еае, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2), проводят анализ смеси культур, выросших на SDS-бульоне или других жидких средах. Подготовку образца для анализа и постановку ПЦР проводят в соответствии с Инструкцией по ее применению (Изложена в МУК4.2.2963-11 в Приложение 7)

При получении  положительных результатов иммунохроматографических экспресс – тестов или в ПЦР - исследовании дают предварительный ответ на наличие в исследуемом образце клеток энтерогеморрагического серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-.

 Проводят  пересев культур микроорганизмов,  выросших на жидких средах, на  чашки Петри со средой Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар, (по три чашки из каждой среды) с таким расчетом, чтобы получить десятки и сотни изолированные колонии микроорганизмов.

Посевы  выращивают при 37 °С в течение 18-24 часов.

                          Третий день исследований.

1) Используя  иммунохроматографические экспресс – тесты определения E.coli O157:Н7/O157:H^-, антительную латексную тест-систему для индикацииE.coli серогруппы O157, в реакции латексной агглютинации (РЛА) среди выросших на питательном агаре изолятов, полученных из неокрашенных сорбитолнегативных колоний (взятых после прямого посева образца с Сорбитол-E.coli 0157:Н7-агара, проводят поиск культур E.coli серогруппы O157. Постановку РЛА проводят согласно Инструкции по ее применению (Изложена в МУК4.2.2963-11 в Приложение 8). Давшие положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс – тестах определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или реакции агглютинации с латексным диагностикумом культуры в этот же день анализируют с помощью мультиплексной ПЦР-тест-системы. Одновременно у культур, которые по результатам РЛА были отнесены к серогруппе O157, изучают биохимические свойства.

2) Производят  пересев сорбитолнегативных неокрашенных колоний, выросших на Сорбитол- E.coli O157:Н7-агаре или идентичных средах (после пересева культур со сред обогащения), на отдельные сектора пластинок питательного агара, разлитого в чашки Петри. При наличии на Сорбитол-E.coliO157:Н7-агаре большого количества сорбитолнегативных колоний необходимо отсеять для последующих исследований не менее 20 изолятов (по 10 колоний на чашку).

                         Четвертый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах  изолятов, выделенных прямым высевом анализируемого образца на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар и давших положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс – тестах для определения E.coli O157:Н7/O157:H^- или агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, еае, stx1 и stx2 (или только stx1 или stx2), специфичные для серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-, и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении в анализируемом материале клеток энтерогеморрагического серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-. В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, а изолированные культуры E.coliO157:Н7/O157:H^- пересылают для дальнейшего их изучения в референс – центры.

В том  случае, если ни один из изолятов, полученных при прямом высеве анализируемого материала на Сорбитол-E.coli O157:Н7-агар, не дал положительную реакцию в иммунохроматографических экспресс – определениях E.coli O157:Н7/O157:H^- или РЛА, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

2) У сорбитолнегативных изолятов, полученных со сред обогащения (см. Третий день исследований, п.2.), определяют принадлежность к E.coliO157:Н7/O157:H^- на иммунохроматографических экспресс – тестах, изучают серологические свойства в РЛА, предназначенной для идентификации E.coliсерогруппы O157.

В случае обнаружения изолятов, давших положительную реакцию на иммунохроматографических экспресс – тестах, положительную реакцию агглютинации в РЛА, их анализируют в ПЦР для обнаружения в их геноме специфических для E.coli O157:Н7/O157:H^- генов rfb, еае, stx1и stx2 (или толькоstx1 или stx2). У этих же изолятов изучают биохимические свойства.

Пятый день исследований.

1) В случае, если при ПЦР-анализе в культурах  изолятов, давших положительную реакцию на иммунохроматографических экспресс – тестах, положительную реакцию агглютинации с латексным диагностикумом, были идентифицированы гены rfb, еае, stx1, stx2 (или только stx1 или stx2), специфичные для E.coli O157:Н7/O157:H^-, и культуры по своим биохимическим свойствам соответствуют виду E.coli, то делают заключение об обнаружении штамма E.coli O157:Н7/O157:H^- в анализируемом образце.

В этом случае все дальнейшие исследования образца прекращают, образец уничтожают, а изолированные культуры E.coli O157:Н7/O157:H^- пересылают для дальнейшего их изучения в референс – центры.

В том  случае, если ни один из изолятов, полученных со сред обогащения, не был отнесен к серогруппе O157, работу с этими изолятами прекращают, а их культуры уничтожают.

Делается  заключение об отсутствии в исследуемом  материале бактерий энтерогеморрагического серовара E.coli O157:Н7/O157:H^-.

6.1.2  Выделение и идентификация E.coli O157:Н7/O157:H- из пищевых продуктов.

Схема выделения Е. coli О157:Н7 из пищевых продуктов

 

Взятие материала и  подготовка его для лабораторного  исследования.

При отборе и подготовке образцов различных видов пищевых продуктов к исследованию руководствуются МУК 4.2.2812-11, Москва, 2011, «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий – возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией», МУК 4.2.992-00 «Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочкиE.coli O157:Н7» и МУ № 04-723/3 от 17.12.84 г «По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями».

Исследование материала.

Выделение культур E.coli O157:Н7/O157:H^- из исследуемых образцов и их последующую идентификацию с помощью иммунохроматографических экспресс – тестов, реакции латексной агглютинации (РЛА) (для обнаружения серогруппы O157) и мультиплексной ПЦР-тест-системы, определение биохимических свойств культур проводят по той же схеме, как и в случае исследования клинических образцов.

Проведение  испытаний различных пищевых  продуктов устанавливает единый метод выявления в определенной навеске пищевого продукта колиформных бактерий в соответствии с ГОСТ Р 50474-93 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)". По классификации кишечных палочек Е. coli 0157:Н7 относится к энтерогеморрагическим, энтеропатогенным кишечным палочкам, поэтому выявление ее как патогена необходимо проводить в 25 г продукта. Возможно выявление Е. coli О157:Н7 в других объемах, регламентированных нормативной документацией на конкретный вид продукта, а также СанПиН 2.3.2.560-96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов"

                                             Проведение анализа.

           Подготовку пищевых продуктов для выявления E. coli О157:Н7 с применением сред обогащения осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 50480-93 "Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella", но в качестве сред обогащения могут быть использованы среда Кесслера, триптозо-соевый бульон, бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, Грам-негативный бульон (GN-бульон). После термостатирования посевов при 37 °С в течение 18-24 ч проводят высев на плотную среду Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар, обладающую дифференциальными и селективными свойствами   . 
  

Таблица 1

Характеристика роста Е. coli О157:Н7 на плотных питательных средах.

Питательная  среда	Характер колоний
Среда ЭНДО	Колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, темно-красные, Lac
Сорбитол Е. coli О157:Н7 агар	Колония средней величины, выпуклые, круглые, влажные, бесцветные, прозрачные. Могут быть бледно-розовые со светлым ореолом, мутноватые
Fluorocult Е. coli О157:Н7 Agar	Прозрачные или полупрозрачные колонии, бесцветные, размером 1,5-2 мм
Простой питательный агар	Колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, блестящие, прозрачные в проходящем свете
Агар Плоскирева, Висмут-сульфит агар, ЖСА, среда Сабуро	Роста нет. Иногда на среде  Плоскирева - мелкие выпуклые колонии красноватого цвета, Lac
Кровяной агар	Колонии средней величины, выпуклые, круглые, влажные, бледноватые, иногда сероватые. Гемолиз отсутствует

 

 

 

           Если на чашке с Сорбитол Е. coli О157:Н7 агаром выросли 1-2 сорбитол-отрицательных колонии, то серологические исследования проводят после посева на одну из сред для первичной дифференциации: агар Клиглера, Олькеницкого, Ресселя. В случае роста на чашке Петри однотипной культуры с 3-5 колониями проводят серологическую идентификацию на стекле с "О"- и "Н"-сыворотками к антигенам Е. coli О157:Н7, либо с латексным антительным диагностикумом. 
          Не менее 5 сорбитол-отрицательных колоний пересевают на среду для первичной идентификации. Посевы инкубируют в термостате при 37 °С 18-24 часа. При получении на следующий день результатов, подтверждающих принадлежность культуры к роду эшерихий (ферментация глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, отсутствие H S), проводят дальнейшую биохимическую и серологическую идентификацию .

 

 

 

 

 

Таблица 2

Антигенные связи Е. соli О157:Н7 и других эшерихий

Е. coli	Наименование сывороток
	О157	Н7
О2-О17 О19-О49 О51-О54 О56-О115 О117-О164	-	-
О50  0116	+	-
О1; О18; О55	-	+
О157:Н7	+	+

 

 

 

            Все штаммы, дающие положительную реакцию агглютинации, подлежат обязательной биохимической идентификации для подтверждения видовой принадлежности. 

 

 

 

 

 

 

Таблица 3

Основные биохимические  свойства Е. coli О157:Н7

№	Тест или субстрат	Наименование штаммов
		Е. соli O157:Н7	Е. соli
1	Сорбитол	-	+
2	-D-глюкуронидаза	-	+
3	Цитрат Симмонса	-	-
4	Мочевина	-	-
5	Малонат натрия	-	-
6	Сероводород	-	-
7	Фенилаланиндезаминаза	-	-
8	Ацетат натрия	+	+
9	Рамноза	±	±
10	Глюкоза (газ)	+	+
11	Лактоза	+	±
12	Сахароза	±	±
13	маннит	+	+
14	арабиноза	+	+
15	адонит	-	-
16	Инозит	-	-
17	Салицин	(±)	±
18	Дульцит	(±)	±
19	раффиноза	±	±
20	ксилоза	+	±
21	Орнитиндекарбоксилаза	+	±
22	Лизиндекарбоксилаза	+	+
23	Аргининдегидролаза	-	±
24	Индол	+	+
25	-D-галактозидаза	+	+
26	Реакция с метиловым  красным	+	+
27	Реакция Фогеса-Проскауэра	-	-