Определение антиоксидантной активности в продуктах пчеловодства

Основными системами метаболизма  флавоноидов являются ферментативные системы печени и кишечной микрофлоры, однако и другие ткани, в частности, стенки тонкого кишечника и почки, по–видимому, тоже могут участвовать  в этих процессах. Поступившие в  печень флавоноиды подвергаются глюкуронидной  и сульфатной коньюгации с образованием глюкуронидов и эфиров серной кислоты, а в ряде случаев и О–метилированию. Невсосавшиеся флавоноиды подвергаются в кишечнике биодеградации под  действием кишечной микрофлоры. Основные процессы на этом этапе — гидролитическое  расщепление гликозидов и коньюгатов, а также деструкция бензольных ядер в агликонах с образованием в  качестве метаболитов различных  гидрокси– и метоксипроизводных ароматических кислот — фенилпропионовой и коричной, которые экскретируются с мочой. По–видимому, с мочой  выводятся и коньюгаты флавоноидов.

Флавоноиды обладают капилляроукрепляющим, противовоспалительным, антиаллергическим, антибактериальным и противовирусным  эффектами. Они оказывают спазмолитическое действие, в том числе на сосуды сердца и головного мозга, положительно влияют на обменные процессы в миокарде, обладают антиаритмическим действием, тормозят агрегацию тромбоцитов  и их адгезию к эпителию сосудистой стенки, нормализуют реологию крови, проявляют антиатеросклеротическое  и антигипертензивное, противоязвенное  и гепатопротекторное действие. Известны флавоноиды, регулирующие гормональный баланс организма, влияя на уровень  кортикоидных гормонов и катехоламинов  и проявляя эстрогеноподобную активность (это характерно прежде всего для  семейства изофлавоноидов — фитоэстрогенов). Ряд флавоноидов обладает антимутагенным и антиканцерогенным действием. Соединения этого класса влияют на состояние иммунной системы, модулируя функцию ее различных звеньев. Столь широкий спектр фармакологической активности флавоноидов определяется их регулирующим и модулирующим действием на ключевые функциональные системы клеток, органов и тканей организма, что проявляется как в локальном, так и в системном ответах организма. [9]

4.  Антиоксидантная активность флавоноидов

 

Одно из более известных  свойств флавоноидов – это  их превосходная антирадикальная активность, что и используется при снижении действия АФК при инфекциях, воспалении, ожогах или лучевом поражении.

Реакция флавоноидов с  АФК характеризуется высокими скоростями.

Флавоноиды легко и  необратимо окисляются до п-гидрохиноновой формы, которая далее обратимо может  окисляться до п-хинона. Последний легко  полимеризуется в не растворимое  соединение. Окисление флавоноидов  катализируется ионами тяжелых металлов и под действием света. Промежуточные  формы окисления флавоноидов могут являться токсичными для клеток, а в процессе их взаимопревращения в ряде случаев образуются АФК (рис. 2).

Рис.2 Окислительно-восстановительные превращения кверцетина (агликон рутина) (Metodiewa D, et.al., 1999; Меньшикова Е.Б., и др., 2006).

 

Одной из причин высокой антиоксидантной активности флавоноидов, является их ингибирующая активность ряда ферментов, включая гидролазы, например фосфолипазы, оксидоредуктазы, фосфатазы, фосфокиназы, оксигеназы, и оксидазы аминокислот. В некоторых случаях, тип ингибирования конкурентный, но чаще это аллостерическое ингибирование. Многочисленные экспериментальные исследования в водных системах позволили выявить следующие наиболее важные для антирадикальной активности структурные элементы молекул флавоноидов:

1) две ОН-группы в положениях СЗ' и С4'

2) двойная связь между  2 и 3 атомами углерода, желательно  совместно с карбонильной группой  в положении С4 и 

3) ОН-группы в положениях СЗ и С5 совместно с карбонильной группой [10].

В молекулах флавоноидов  ОН-группа в положении С4' представляет собой наиболее предпочтительную мишень для радикальной атаки, при этом наличие ОН-групп у соседнего  атома углерода СЗ' (катехоловая  структура) или СЗ' и С5' (галловая структура) облегчает отрыв атома  водорода. Между соседними гидроксилами кольца В образуются водородные связи, поэтому соединения, имеющие такие  структуры, характеризуются низким окислительным потенциалом и  относительно легко образуют радикалы [11, 12]. Кроме того, присутствие opтo-дигидроксильной структуры приводит к большей делокализации неспаренного электрона и повышает стабильность феноксилыюго радикала [10]. Синтезированные на структурной основе флавона соединения, не содержащие ОН-групп в В-кольце, не проявляли существенной антиоксидантной активности [13]. Катехоловые структуры также эффективно связывают ионы металлов переменной валентности, препятствуя тем самым их вовлечению в реакции разложения гидроперекисей. Прежде всего это касается катехоловых структур В-кольца, однако при Fe +- и Ре3+-индуцированном окислении, так же, как в отношении ОН-радикалов в реакции Фентона и пероксинитрита, выраженный ингибирующий эффект дают соединения, содержащие ОН-группы в положениях С7 и С8 или С5 и С6 [13, 14, 15]. Замена ОН-групп в положениях С5, С7 или СЗ на O-D-глюкозу приводила к снижению способности флавоноидов ингибировать перекисные и ОН-радикалы, а также ONOO^- [15].

Важность двойной связи  С2-СЗ для антиоксидантного действия флавоноидов, по-видимому, определяется образованием диеновой структуры между атомом кислорода в положении С4 и электронной структурой В-кольца, что приводит к делокализации электронной плотности по всей молекуле при образовании радикала. Действительно, экспериментальное исследование показало несколько большее смещение в область С-кольца спиновой плотности неспаренного электрона в радикале кверцетина, имеющем ненасыщенную связь С2-СЗ, по сравнению с аналогичным по структуре радикалом таксифолина, у которого эта связь одинарна. Кроме того, наличие двойной С2-СЗ-связи ограничивает подвижность В-кольца и способствует формированию планарной структуры молекулы, что важно для ингибирования ферментативной продукции АФК, в частности, в ксантин-ксантиноксидазной реакции [16].

Несмотря на большое количество исследований in vitro и несомненный  факт наличия флавоноидов в рационе  питания человека и животных, убедительных доказательств доминирующего антиоксидантного действия флавоноидов в каких-либо процессах в организме in vivo нет.

5.  Металлсвязывающая способность флавоноидов

 

Флавоноиды также могут  действовать как хелаторы ионов  металла с радикалами О^- и ОН*, так и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для перекисных радикалов. Многие флавоноиды действуют как хелаторы ионов металлов переменной валентности и способны, таким образом, ингибировать процессы ПОЛ на стадии разветвления цепей, когда ионы металлов индуцируют гомолиз органических перекисей. Для связывания ионов металлов важно наличие в молекулах дигидроксильной структуры в В-кольце (предпочтительна катехоловая структура с ОН-группами в СЗ'- и С4'-положениях), а также кетогруппы в положении С4 совместно с СЗ- или С5-гидроксилом [17]. Такие структуры имеют молекулы флавонолов (мирицетин, кверцетин, рутин и др.), флавонов (гиполактин, лютеолин, ориентин и др.), дигидрофлавонолов (таксифолин, фустин), поэтому хелатирование ионов металлов переменной валентности представляет собой важный механизм антиоксидантного действия в биологических системах природных флавоноидов, обычно представленных в виде сложной композиции разных классов молекул. Окисление линоленовой кислоты, индуцированное ионами Fe²⁺ совместно с Н₂0₂, ингибировалось рутином и кверцетином в большей степени за счёт связывания ионов железа, нежели в результате ингибирования радикалов [18].

6. Ингибиторная активность флавоноидов

 

Флавоноиды ингибируют процессы ПОЛ как на стадии инициации, взаимодействуя с радикалами О^- и ОН*, так и на стадии продолжения цепи, выступая донорами атомов водорода для перекисных радикалов. Образующиеся при этом радикалы флавоноидов активно вступают в реакции диспропорционирования с другими радикалами. Флавоноиды эффективно ингибировали супероксидные анион-радикалы, возникающие при взаимодействии Н₂0₂ с ацетоном в щелочной среде, для антирадикальной активности важным было присутствие гидроксильных групп в В-кольце и положении СЗ, при этом агликоны были более эффективны, чем гликозилированные формы [19].

Структурный анализ и экспериментальные  данные свидетельствуют о прямой взаимосвязи между антиоксидантной  эффективностью флавоноидов и количеством  фенольных ОН-групп в их молекулах. Исследование разных по структуре флавоноидов показало, что соединения без ОН-заместителей или с одной гидроксилыгой группой в положении С5 флавонового ядра не проявляют сколько-нибудь значимой активности в отношении перекисных радикалов [20]. Многие флавоноиды, такие как кверцетин, мирицетин, лютеолин, рамнетин, силибинин, не только обладают антиоксидантной активностью, но и способны ингибировать циклооксигеназы 1 и 2 типа, липоксигеназы и тем самым снижать продукцию провоспалительных медиаторов: лейкотриенов, простагландинов и активных форм кислорода [21]. Супрессивная эффективность флавоноидов в отношении 5-липоксигеназы и циклооксигеназы перитонеальных лейкоцитов крыс коррелировала с их способностью связывать и восстанавливать ионы железа [22].

В сложных системах, таких  как индуцированное ионами металлов переменной валентности окисление  линоленовой кислоты в гепатоцитах [17], прямой взаимосвязи антиоксидантного действия флавоноидов с определёнными структурными элементами их молекул выявить не удаётся, что объясняется исследователями наличием в молекулах флавоноидов нескольких центров связывания ионов металлов.

Помимо того, что флавоноиды обладают антирадикалыюй активностью  и могут связывать ионы металлов переменной валентности, они аналогично токоферолу и холестерину стабилизируют  мембраны и выступают в качестве структурных антиоксидантов. Проникая в гидрофобную область мембран, молекулы флавоноидов значительно  снижают подвижность липидов, что  в свою очередь, снижает эффективность  взаимодействия пероксильных радикалов  с новыми липидными молекулами (RО₂* + RH —> ROOH + R*); так как в большинстве биологических мембран данная стадия цепных процессов ПОЛ является лимитирующей, то, соответственно, снижается скорость всего процесса окисления [13].

 

3. Практическая часть

 

Исследуемыми веществами выбраны спиртовые экстракты 10% перги, пыльцы и прополиса, экстрагированные 40, 70, 95% спиртом.

Первым этапом нашего исследования было компьютерное моделирование структуры  и свойств полифенолов на примере рутина (рис. 3).

Рис. 3 Визуализированная молекула рутина, оптимизирована в вакууме.

 

Исследование проводилось  при помощи программного пакета вычислительной квантовой химии «gamess» [23].

Следующим этапом являлось исследование антиоксидантных свойств продуктов пчеловодства в реакциях In vitro. Один из широко используемых подходов для определения активности супероксиддисмутазы, катализирующей дисмутацию супероксида в кислород и пероксид водорода, основан на реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде. [24] Обнаружено, что в процессе аутоокисления низких концентраций адреналина (230мкМ) в щелочной среде (pH = 10,65) при комнатной температуре в отсутствие дополнительных источников окисления интенсивно нарастает поглощение с максимумом при 347 нм за счет образования адренохрома (рис. 4).

Рис. 4 Реакция  окисления адреналина в адренохром.

 

Установлено, что образование  адренохрома ингибируется некоторыми исследованными антиоксидантами, к  числу которых относятся флавоноиды. Определение проводили по методике. К 4 мл 0,2 М натрий - карбонатного буфера, рН = 10,65 добавляли 0,2 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида, тщательно перемешивали, выдерживали в течение 20 минут в термостате при температуре 25±1⁰С и измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм при 347 нм (А₁). Параллельно проводили такое же определение с растворами исследуемых соединений, добавляя их в количестве 0,02 мл (А₂). Величину АОА рассчитывали по формуле:

_,

где А1 – Оптическая плотность  раствора, без добавления исследуемого вещества, А2 – оптическая плотность  раствора с добавлением исследуемого

вещества.

 Далее была исследована способность антиоксидантов нейтрализовывать пероксид водорода в реакции с растворами аммония молибдата, с которыми перекись взаимодействует с образованием иона пероксимолибдата. Данная способность характеризуется как противопероксидная активность. Установлено, что при этом образуется окрашенный комплекс пероксимолибдат-иона с максимумом светопоглощения при 410 нм. При добавлении в инкубационную смесь вещества с антиоксидантной способностью, способного нейтрализовывать перекись водорода, оптическая плотность раствора снижается пропорционально активности исследуемого вещества.

Для разработки методики анализа и построения калибровочного графика, в мерную колбу вместимостью 25 мл, помещали 1, 2, 3, 4, 5мл 0,02 М раствора аммония молибдата, 1 мл 3% раствора пероксида водорода и 0,1 грамм эквивалент кислоты серной и доводили объем раствора водой до метки. Выдерживали в течение 20 минут при температуре 25⁰С. Измеряли оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре СФ-56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Было установлено, что максимум в области 410 нм наблюдается только в разведении аммония молибдата    2,4*10 ^-6М (3 мл). Поэтому дальнейшие исследования проводили с таким количеством реактива.

Определение проводили по методике: в мерную колбу вместимостью 25 мл, помещали 3мл 0,02 М раствора молибдата аммония, 1 мл раствора пероксида водорода 3% и 0,1 грамм эквивалент кислоты серной, прибавляли по 0,1 или 0,2 мл 1% водного или спиртового раствора определяемого вещества и доводили объем раствора водой до метки. Выдерживали в течение 20 мин, при температуре 25⁰С. Измеряли оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 410 нм. В качестве раствора сравнения использовали аналогичную смесь без добавления пероксида водорода. Величину противоперекисной активности, рассчитывали по формуле:

                                              _,

где А1 – Оптическая плотность  раствора, без добавления исследуемого вещества, А2 – оптическая плотность  раствора с добавлением исследуемого

вещества.

_{3.1. Результаты и их обсуждение.}

 

_{В ходе компьютерного моделирования  за теоретическую  антиоксидантнную активность была принята энергия  верхней занятой  молекулярной орбитали (ВЗМО). Чем Выше энергия  ВЗМО тем сильнее  проявляются восстановительные  свойства вещества. Т.о. вещество с более  сильными восстановительными свойствами легче  отдает электрон, обеспечивая  тем самым восстановление свободо-радикального соединения.}