Виробництво рибофлавіну(вітамін В2)

Для одержання кормового  препарату рибофлавіну кудьтуральну рідину випарюють у вакуумі до З0—40 % сухих речовин, і сироп висушують на розпилювальній сушарці, суху плівку подрібнюють до порошкоподібного стану. Одержаний продукт із залишковою вологістю 8 %, що містить 1.5— 2,5 % рибофлавіну, 20 % білка, тіамін, нікотинову кислоту, піродоксин, ціанкобаламін, мікроелементи та інші речовини, викорнстовується у тваринництві.

У разі високого вмісту рибофлавіну  останній можна виділяти як індивідуальну речовину (субстанцію) медичного призначення.

                   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                    3.ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ

 

3.1.Характеристика  продуцентів

Продуценти. Рибофлавін синтезує більша частина вищих рослин та багато мікроорганізмів, включаючи бактерії, дріжджі та гриби. Тварини не здатні до самостійного синтезу рибофлавіну, і їх потреба в ньому задовольняється мікрофлорою ШКТ та їжею.

Мікроорганізми-продуценти рибофлавіну поділяють на 3 групи:

• слабкі (Clostridium acetobutylicum);
• помірні (дріжджі Pichia guilliermondii, Candida flareri);
• сильні суперпродуценти (Eremotecium ashbyii, Ashbya gossipii).

 

На середовищі з глюкозою E. ashbyi здатен синтезувати до 3,8 г/л, A. gossipii - до 6,4 г/л рибофлавіну. Саме ці гриби використовують зазвичай при отриманні рибофлавіну мікробіологічним способом, проте описані способи отримання його за допомогою Pichia guilliermondii [6]. Недоліком використання дріжджів P.guilliermondii в промисловості є їх дуже велика чутливість до іонів заліза, середовища культивування потребують ретельної чистки від іонів Fe. На біосинтез рибофлавіну E. ashbyi та A. gossipii іони заліза не впливають, що є важливою перевагою для використання цих продуцентів в промисловості [7]. Недоліком E. ashbyi є нестабільність мікроорганізму при зберіганні. Недоліком A. gossipii є дуже тривалий процес культивування та складні та дорогі середовища.

Перший етап перетворення рибофлавіну у коферментні форми каталізує рибофлавінкіназа (РФ-кіназа) - АТФ-залежний фермент, який фосфорилює рибофлавін з утворенням РФ-5'-фосфату (ФМН).

Серед грибів високу питому активність РФ-кінази мають A.gossipii й E.ashbyii - відомі промислові продуценти рибофлавіну і ФАД [8, 9].

У Львівському інституті  біології клітини HAH України та Львівському національному університету імені Івана Франка проведені дослідження генетичних механізмів регуляції біосинтезу рибофлавіну у еукаріотичних мікроорганізмів. Зручною моделлю для досліджень обрані дріжджі Pichia guilliermondii [10].

У дріжджів Pichia guilliermondii виявлено регуляцію біосинтезу рибофлавіну за позитивним і негативним типом дії. Показано, що дефіцит заліза в середовищі або пошкодження регуляторних генів негативного типу дії RIB80, RIB81, HIT1 і RED1 спричиняють дерепресію майже всіх ферментів флавіногенезу та як наслідок - надсинтез РФ у вищезгаданих дріжджів. Ці ж гени контролюють також асиміляцію заліза у P.guilliermondii, запобігаючи його надмірному нагромадженню у клітинах. Очевидно, у P.guilliermondii функціонує механізм, який координує як постачання дихального ланцюга обома кофакторами - флавінами та залізом, так й інші потреби клітини в іонах заліза [11, 12, 13].

У львівському інституті  біології клітини HAH України сконструйований генно-інженерний штам флавіногенних дріжджів Candida famata з високою активністю рибофлавінкінази [14].

Bacillus subtilis - продуцент рибофлавіну. Природні штами B. subtilis синтезують рибофлавін тільки в кількості, необхідній для підтримки власної життєдіяльності і зовсім не виділяють його в середовище. У ВНДІ генетики та селекції промислових мікроорганізмів під керівництвом СтепановаА.І. створено промисловий продуцент рибофлавіну на основі B. subtilis. Спочатку були отримані мутанти, стійкі до розеофлавіну -структурного аналогу рибофлавіну. Дані мутанти мали здатність виділяти в культуральне середовище до 10 мг/л вітаміну. На другому етапі були отримані мутації в гені-регуляторі, що кодує регуляторний білок, здатний впливати на експресію рибофлавінового оперону. Це дозволило отримати штам, що продукував до 100 мг/л вітаміну. На наступному етапі отримані мутації стійкості до аналогу пурину, що також призвело до росту продукції рибофлавіну.

Наступним етапом було створення  рекомбінантного штаму B. subtilis. Генно-інженерними методами була сконструйована рекомбінантна плазміда рМХ45, яка несла в собі розрегульований рибофлавіновий оперон B. subtilis та ген стійкості до еритроміцину. Ця плазміда була внесена в штам B. subtilis, що за рахунок збільшення кількості копій рибофлавінового оперона дало можливість отримувати до 3-4 г/л вітаміну на комплексних поживних середовищах. В результаті подальших селекційних робіт були отримані мутанти, ауксотрофні по аденіну, та мутанти з порушеною транскетолазою та глутаматсинтетазою.

Все це, а також підібраний склад середовища та умов культивування, дозволило отримувати до 8-12 г/л рибофлавіну [4, 15].

Проведені дослідження показали, що плазміда рМХ45 є стійкою протягом 50 генерацій на твердих поживних середовищах. Єдиною умовою елімінації плазміди є збільшення температури вище 45°С. Технологічну схему виробництва кормового препарату рибофлавіну наведено на рис. 2.

Параметри ферментаційного  процесу: температура - 37-40°С, аерація, перемішування, pH підтримується 6,8-7,5, піногасник подають за необхідністю, тривалість 50-72 години.

За необхідності отримання  кристалічного рибофлавіну кристали рибофлавіну у культуральній рідині переводять у повністю розчинний стан за рахунок нагрівання та додавання концентрованої соляної кислоти. Гарячий розчин фільтрують. Фільтрат охолоджують та додають відновник. Отримують технічні кристали рибофлавіну(див.додаток 1).

Е. аshbуі належить до класу сумчастих грибів, або аскоміцетів. Він паразитує на коробочках хлопчатнику, утворює справжній розгалужений багатоядерний міцелій, що зрідка септований, плодових тіл не утворює. Міцелій має яскраво-жовтий колір, що зумовлено присутністю рибофлавіну, який накопичується в такій кількості, що випадає у вигляді кристалів у вакуолях. Аски утворюються з продовгуватих вегетативних клітин або клітин міцелію без  попередньої  кон'югації та  незабаром  після  дозрівання руйнуються з визволенням спор. Аскоспори по 8-32 в аску, веретеноподібні, голкоподібні.

Відомо, що штами E. ashbyi дуже нестабільні, утворення рибофлавіну дуже змінюється навіть при ідентичних умовах культивування. E. ashbyi можливо зберегти в активному стані 8-10 місяців шляхом систематичного розсіву на тверді поживні середовища та відбору найбільш інтенсивно забарвлених в жовтогарячий колір колоній [17].

Для Candida guilliermondii важливо регулювати вміст заліза у поживному середовищі, оптимальні концентрації іонів заліза становлять 0,005— 0,05 мкг/мл. За таких умов певні штами дріжджів можуть утворювати за 5—7 днів більше як 0,5 г/л вітаміну. Звичайно, для промислового виробництва такий вихід рибофлавіну занадто низький, тому нині як продуценти використовують штами грибів — Е. ashbyi та Ashbyi gossypii.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                 4.ОСНОВНИЙ ПРОЦЕС ФЕРМЕНТАЦІЇ

 

Об'єктом дослідження є штам Eremothecium ashbyi F340, отриманий із Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (таксономічне положення: царство Fungi, відділ Ascomycota, клас Hemiascomycetes, порядок Saccharomycetales, родина Spermophthoraceae [11, 12]).

Штам  гриба зберігаєтьсяся при кімнатній температурі на скошеному агаризованому глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) складу: дріжджовий екстракт — 0,5 %; пептон — 0,3; глюкоза — 1,0; агар — 2,0 %.

З метою  дослідження росту на щільних  середовищах E. ashbyi культивуєтьсяся на агаризованих ГПС, соєвому середовищі, середовищі Чапека-Докса, картопляно-декстрозному середовищі (КДА) та сусло-агарі.

Культивування на рідких середовищах здійснюєтьсяся при Т=28 °С протягом семи діб у конічних колбах з 50 мл рідкого поживного середовища на качалці зі швидкістю 180 об/хв. Для цього використовуютьсяся глюкозо-пептонне середовище (ГПС), середовище Чапека—Докса [13], соєве середовище [10], середовище Городкової та сусло (330 мл неохмеленого пивного сусла на 1 л води). Посівний матеріал отримується на ГПС і вноситься у кількості 5 %.

Кількість біомаси визначається ваговим методом після її відділення від культуральної рідини та висушування до сталої маси при 105 °С. Вміст рибофлавіну визначаєтьсяся спектрофотометрично при X = 450 нм після попереднього кип'ятіння культуральної рідини з біомасою протягом 30 хв і гідролізу ФАД до ФМН протягом 12 год у 10 % ТХО [14]. Визначення редукуючих речовин на початку та в кінці культивування здійснюється фериціанідним методом (метод Хагедорна— Ієнсена) [15].

Біосинтез рибофлавіну стимулюється додаванням ненасичених жирних кислот, насичені, навпаки, гальмують його утворення. Розвиток E. ashbyi стимулюється додаванням біотину, тіаміну, інозиту. Піримідинові та пуринові основи є попередниками утворення рибофлавіну і також можуть бути використані для інтенсифікації його біосинтезу. Найкращим стимулятором є ксантин [19].

 

Системи отримання, тонкого очищення та стерилізації аераційного повітря

 

Для потреб технології (головним чином аерації при культивуванні) на сучасних заводах тонкого мікробіологічного  синтезу необхідно отримувати сотні  тисяч кубічних метрів на годину стерильного  повітря з коефіцієнтом проскакування порядку 10^-8— 10^-11%. Крім того, повітря повинно мати надлишковий тиск близько 0,2 МПа, температуру в межах 20—40°С  і вологість не більше 80%. Остання вимога пов'язана з використанням в якості основних апаратів на завершальній стадії очищення фільтрів тонкого очищення.

Існуючий рівень розвитку техніки не дозволяє отримувати в  одному апараті великі маси стерильного  аераційного повітря, що відповідає перерахованим вимогам. Принципова схема типової системи здобуття, тонкого очищення та стерилізації аераційного повітря приведена на рис. 7.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис 7. Схема здобуття, очищення та стерилізації аераційного повітря

 

Забір повітря з атмосфери  відбувається через спеціальні шахти, які, як правило, мають висоту більше 8—10 м і розташовуються на найменш забруднених ділянках території заводу.

Як перед-фільтри 1 грубого очищення повітря використовуються фільтри Рекка або масляні фільтри з насадкою з кілець Рашига і стружки, змоченою вісциновим, веретенним або трансформаторним маслом, а також фільтри, що самоочищаються (так звані циклофільтри). Швидкість фільтрації через ці фільтри складає 1—2 м/с, а коефіцієнт проскакування від загального вмісту твердої фази (пилу) близько 10%.

Щоб подолати опір системи  очищення повітря і стовпа рідини в культиваторі, а також створити в ньому деякий надлишковий тиск, повітря необхідно стиснути до тиску не менше 0,2 МПа. У більшості випадків для цих цілей застосовуються турбокомпресори 2, які не дивлячись на декілька менший ККД в порівнянні з ККД звичайних поршневих компресорів мають переваги з точки зору стерилізації повітря. У турбокомпресорах повітря нагрівається до вищих температур і не забруднюється маслом, яке ускладнює подальше очищення та стерилізацію повітря.

Після стискання повітря  з нього видаляється волога, щоб  виключити зволоження фільтрів тонкого  очищення. Для цих цілей встановлюють холодильник 3 і вологовідділювач 4. У холодильнику (зазвичай кожухотрубчатому) повітря охолоджується оборотною або охолодженою водою. Краплинна волога, що виділяється при охолоджуванні стислого повітря, уловлюється у вологовідділювачах, в якості яких застосовуються циліндрові апарати з насадкою або пастки інерційного типу. Відділення вологи в цих апаратах відбувається в результаті багаторазової зміни напряму руху повітря і великої поверхні контакту в пастках насадок або в результаті зміни швидкості повітря від 5—15 до 0,5—2 м/с і напряму його руху в пастках інерційного типу.

При великій протяжності (сотні метрів) трубопроводів від  компресорної до цеху-споживача перед головним фільтром встановлюється додатковий вологовідділювач  або підігрівач 5, який захищає головний фільтр від зволоження. Головний фільтр 6 зазвичай розташовується в місці введення трубопроводу в цех-споживач. Відстань від головного фільтру до індивідуальних фільтрів, які розміщуються безпосередньо у культиватора, може досягати сотень метрів і більше. Тому перед індивідуальним фільтром тонкого очищення також встановлюють підігрівач 7. Зважаючи на те, що необхідну відносну вологість (70—80%) перед індивідуальним фільтром 8 вдається забезпечити при нагріві повітря на 10—15° С, як підігрівач зазвичай використовують ділянки повітряводів, що підігріваються парою.

Нормальне функціонування системи  очищення повітря неможливе без  підтримки певних термодинамічних  параметрів повітря (тиск, температура, вологість). Надмірний перегрів аераційного  повітря може негативно вплинути на життєдіяльність мікроорганізмів і викликати збільшення витрати охолоджуючої води. Недоцільне і надмірне осушення аераційного повітря, оскільки це спричинює відповідне випаровування культуральної рідини. Визначальним параметром є відносна вологість повітря перед головним та індивідуальними фільтрами, при якій призупиняється конденсація вологи. Для визначення режиму роботи всієї системи очищення повітря та кожного її елементу окремо необхідний розрахунок термодинамічного стану повітря в найбільш характерних точках залежно від вихідних параметрів повітря (температури, тиску і вологості), які у свою чергу залежать від пори року. Як показують такі розрахунки, оптимальний режим роботи системи очищення повітря може бути досягнутий як при частковому відділенні вологи у вологовідділювач, так і без відділення вологи.

 

       

 

 

 

                    5.ОДЕРЖАННЯ ГОТОВОГО ПРОДУКТУ