Специфічність ферментів

 

Оптично активні субстрати

 

Ферменти  крім хімічної специфічності також  володіють стереоспецифічністю по відношенню  до молекул які мають асиметричний атом. Встановлено, що при дії ферментів на молекули, які містять хіральний атом вони атакують лише один оптичний ізомер. Специфічність даного типу абсолютна якщо в реакцію вступає асиметрична група, наприклад окислення СНОН-групи оксикислот. Але якщо асиметрична група в молекулі субстрату знаходиться на деякій відстані від групи, що вступає в реакцію ферментом зазвичай атакуються обидва ізомери; правда спостерігається більш-менш виражена різниця в швидкості реакцій.

В тих  випадках, коли субстрат є симетричною  молекулою, а продукт містить  асиметричний атом вуглецю, то під дією ферменту завжди утворюється лише один оптичний ізомер. Наприклад, при відновленні  пірувату лактатдегідрогеназою (КФ 1.1.1.27) утворюється лише L-лактат, але таж реакція, що каталізується іншою дегідрогеназою (КФ 1.1.1.28) дає тільки D-лактат; при відновленні амонійної солі 2-оксоглутарату L-глутаматдегідрогеназами (КФ 1.4.1.2-4) утворюється L-глутамат; фосфорилювання гліцерину гліцеролкіназою (КФ 2.7.1.30) призводить до утворення тільки sn-гліцерол-3-фосфату. При синтезі L-треоніну шляхом конденсації гліцина з ацетальдегідом одночасно утворюються 2 хіральних атома вуглецю. В сполуках, що мають декілька асиметричних центрів, кожен центр може впливати на специфічність ферменту.

Коли  стереохімічна специфічність абсолютна  ізомер, що не атакується не впливає  на швидкість перетворення субстрату; але іноді він виступає як конкурентний інгібітор і, отже, зв’язується з  активним центром ферменту. Використовуючи цю обставину можна визначити ступінь спорідненості при даній взаємодії. Подібні дослідження продемонстрували, що в деяких випадках спорідненість ізомеру, що виступає в ролі інгібітору значно вища ніж у субстрату.

Дія хімотрипсину була досліджена на великій кількості синтетичних субстратів, і в багатьох випадках стереоспецифічність виявилась не абсолютною. Відносний вибір одного з ізомерів значно відрізняється в залежності від природи субстрату (Таблиця 1).

Табл.1  Стереоспецифічність хімотрипсину по відношенню до субстратів із загальною формулою R₁CHR₂COOR₃

Субстрат		Kм, мМ	V, c-1	v/Kм	VL/VD	(v/Kм)L/(v/Kм)D
Ацетилфенілаланін (метиловий ефір)	L	1,8	63,1	3.5*104
	D	2,3	-	-
Формілфеніналанін (метиловий ефір)	L	Дуже низька	Дуже низька	104		104
	D	0,25	0,0034	13,83
Бензоілаланін (метиловий ефір)	L	9,75	0,26	26,8	23,6	8,23
	D	3,29	0,011	3,25
3-карбметокси-3,4-дигідроізокарбостирил	L	11,69	0,12	10,61	0,005	2,46*10-4
	D	0,53	22,7	4,31*104
Етиловий ефір α-ацетоксипропіонової к-ти	L	1,7	0,00036	0,021	0,18	1,9
	D	180	0,02	0,11
Метиловий ефір N-піколілаланіна	L	18	0,07	3,89	0,42	0,4
	D	17	0,165	9,71

 

 

L-ізомер метиловий ефір ацетилфенілаланін піддається гідролізу хімотрипсином в значній мірі, а D-ізомер взагалі не гідролізується; для відповідного формільного похідного відносна перевага L-ізомеру є також досить високою. Разом з тим у випадку похідних аланіну гідроліз L-ізомерів виражений значно менше. Для останніх сполук наведених у таблиці характерний гідроліз D-ізомерів.

Хейн та Німан запропонували пояснення результатів в межах загальних уявлень про специфічність хімотрипсину, що базуються на постулюванні взаємодії трьох груп субстрату з трьома ділянками в активному центрі ферменту. Якщо три ділянки, що взаємодіють з R₁, R₂ та COOR₃-групами субстрату (де R₁ – ацильна група, R₂ – радикал амінокислоти, що утворюють зв’язок, який гідролізується), позначити ρ₁, ρ₂, ρ₃ відповідно, то, згідно постулату авторів, гідроліз буде відбуватися лише в тому випадку, коли ефірна група COOR₃ (або інша група) правильно орієнтована в ділянці ρ₃.

Розміщення  ділянок ρ₁, ρ₂, ρ₃ в активному центрі ферменту таке, що у випадку взаємодії нормального субстрату, такого, як метиловий ефір ацетилфенілаланіна, його L-ізомер здатен взаємодіяти із ферментом необхідним чином R₁ з ρ₁, R₂ з ρ₂, COOR₃ – ρ₃, а D-ізомер не здатен зайняти відповідне положення. У випадку якщо R₁ та R₂ невеликі за розміром то перешкоди для альтернативного варіантів взаємодії зменшуються, і R₁ група може взаємодіяти із ρ₂, а R₂ – з ρ₁; зв’язування L-ізомеру ферментом може виявитись не оптимальним для каталізу, і величина V знижується; в той же час у відповідного D-ізомеру субстрату виникає можливість заняти положення, яке є каталітично ефективним; таким чином, ступінь стереоспецифічності знижується.

Фіксація  R₁ в гідрофобній кишені хімотрипсину і R₂ за рахунок водневого зв’язку і гідрофобних взаємодій призводить до того, що карбоксильну група у випадку L-ізомеру знаходиться в зоні дії атакуючого нуклеофілу. Для D-ізомеру реакційний центр субстрату віддалений від нуклеофільного агенту (Рис.1). Для гідролізу D-ізомерів необхідна переорієнтація R₁ та R₂ груп субстрату при цьому R₂ повинна взаємодіяти із “гідрофобною кишенею”  сорбційного цетру.

         Акцептор Н-зв’язку                                               Акцептор Н-зв’язку

Нуклеофіл         Гідрофобна кишеня                Нуклефіл         Гідрофобна кишеня                  

Рис. 1 Розміщення оптичних ізомерів в активному центрі хімотрипсину.

На рис. 2 наведена структура трьох субстратів хімотрипсину. Бензольна група (R₁) D-ізомеру метилового ефіру бензоілаланіну здатна взаємодіяти із ρ₂-ділянкою, яка «нормально» взаємодіє із бічним ланцюгом ароматичної амінокислоти L-ізомеру, при цьому у деяких взаємодіючих таким чином молекул ефірна група опиняється в сприятливій для каталізу орієнтації по        

 

а     б    в

Рис. 2 Структура деяких субстратів хімотрипсину: а – метилового ефіру формілфенілаланіну; б – метилового ефіру бензоілаланіну; в – 3-карбометокси-3,4дигідроізокарбостирилу.

відношенню  до ρ₂. Кільцева структура третього субстрату значно зменшує кількість можливих його орієнтацій в активному центрі, і D-ізомер жорстко утримується в ефективному для каталізу положенні.  Внаслідок цього активність ферменту у відношенні до L-ізомеру карбометоксидигідроізокарбостирилу виявляється такого ж порядку, як і у відношенні до метилового ефіру L-бензоілаланіну, а активність у відношенні до D-ізомеру значно підвищується, що й призводить до зміни специфічності.

 

Цис-транс-ізомери

 

Специфічність ферментів може визначатися не тільки D,L-ізомерією, а також іншими типами стереоізомерії. Якщо фермент атакує субстрат в цис-конфігурації, то він як правило не діє на транс-ізомер даної сполуки, і навпаки. Фумарат-гідратаза, наприклад, діє тільки на фумарат і взагалі не діє малеінат; крім того, вона каталізує утворення із малату тільки фумарату. Таким чином, цей фермент проявляє стереоспецифічність двох типів: у відношенні до фумарату в одному напрямку реакції і у відношенні до L-малату – в іншому.

Але ряд  ферментів однаково добре взаємодіє  із обома ізомерами. В тих випадках, якщо в ході реакції порушується  асиметрія оптичного активного  центру, відповідні ферменти діють  як рацемази, оскільки вони можуть перетворювати L-форму субстрату в симетричну проміжну сполуку і внаслідок зворотної реакції утворювати рацемічну суміш (наприклад, лізин рацемаза, ферменти підгрупи 5.1). Якщо фермент добре взаємодіє, як із цис-, так і з транс-формами будь-якої сполуки і вході реакції утворюється молекула, в якій можливе вільне обертання навколо відповідного зв’язку (наприклад, в результаті приєднання молекули глутатіона до подвійного звязку), то такий фермент діє як цис-транс-ізомераза (наприклад, малеінат-цис-транс-ізомераза, ферменти підгрупи 5.2). Епімеризацію цукрів можна розглядати як D-L-зміну при певному вуглецевому атомі вуглеводного кільця; вона може здійснюватися ферментами, які не володіють специфічністю до якої-небудь однієї стереохімічної конфігурації при відповідному вуглецевому атомі (пентозо-5-фосфат 3-епімераз, ферменти підгрупи 5.1.3).

 

Стереоспецифічність у відношенні до симетричних молекул

 

Ферменти  також здатні розрізняти в симетричних  молекулах групи, які хімічно  є ідентичними. Так, наприклад, в  реакції:

Сx₂yz → Cx’xyz

де x, y і z – хімічні групи приєднані до атому вуглецю, фермент може діяти лише на одну з двох хімічно ідентичних х-груп. Доказом є утворення лише одного оптичного ізомеру асиметричної молекули Cx’xyz. При фосфорилювання гліцерину під дією гліцерокінази утворюється лише sn-гліцерол-3-фосфат.  Асиметричне фосфорилювання симетричної молекули гліцерину було підтверджене радіоізотопним методои. Плказано, що при фосфорилювання 1-¹⁴С-гліцерину отриманого в результаті відбувається така хімічна реакція:

Подібна специфічність характерна для ферментів  циклу  трикарбонових кислот, які  приймають участь у розпаді лимонної кислоти. При хімічному розщепленні  лимонної кислоти, утвореної ферментативним шляхом з ¹⁴СООСН₂СОСООН, встановлено, що ¹⁴С включається лише в одну кінцеву карбоксильну групу. Так, як молекула лимонної кислоти є симетричною, то хімічно не можливорозрізнити дві СН₂СООН-групи. Але при ферментативному окисленні цієї лимонної кислоту утворюється 2-оксоглутарат, мічений лише по α-карбоксилу:

.

Звідси  випливає, що в лимонної кислоти  вся мітка знаходиться лише на одній із кінцевих карбоксильних  груп і,відповідно, окисна ферментативна система здатна розрізняти ці кінцеві групи. 

Перші дві  стадії каталізуються цитрат (si)-синтазою і аконітат-гідратазою. Можна очікувати, що в першій реакції двохвуглецевий залишок приєднується як із однієї сторони площини С-СО-С-групи, так і з іншої. Але той факт, що в лимонної кислоти мітка знаходиться тільки в “верхній” карбоксильній групі, говорить про те, що фермент каталізує приєднання двохвуглецевого залишку лише з однієї сторони площини молекули; в іншому випадку мітка виявлялася б і в “нижній” карбоксильній групі. В другій реакції аконітат-гідратаза діє лише на одну з двох хімічно еквівалентних СН₂СООН-груп – “верхню”.

Пояснення даного типу специфічності вперше запропонував Огстон, а потім були детально розроблені Гіршманом. Вважається, що в активний центр ферменту містить три ділянки, які взаємодіють із трьома групами субстрату Сx₂yz в певній конфігурації, так що субстрат може зв’язуватись з ферментом тільки в одній орієнтації, хоча молекула й симетрична. Тому ділянка ферменту, що зв’язує х-групу субстрату, завжди буде взаємодіяти з однією і тією ж х-групою, і якщо реакцію буде здійснювати саме ця група ферменту, то реагувати тілька ця певна х-група субстрату. На рис. 3 зображені дві можливі структури фермент-субстратного комплексу.

Модель  основану на взаємодії трьох груп субстрату з ферментом, не слід розглядати, як абсолютну, тобто як таку яку можна  використовувати у всіх випадках, коли зустрічається стереоспецифічність  даного типу.

Рис. 3 Стереоспецифічність ферменту у відношенню до субстрату Сx₂yz

На схемі  представлені дві можливі структури  фермент-субстратного комплексу. Молекула субстрату зображена у вигляді тетраедра з групами x, y та z у вершинах. Зліва фермент взаємодіє з двома х-групами и у-групою, а справа – тільки з однією х-групою, а також з у- та z-групами. Букви X, Y та Z в колах зображають групи ферменту, що взаємодіють із відповідними групами субстрату. Особливим колом відмічена група Х, при взаємодії з якою х-група субстрату стає реакційно здатною. В обох випадках в реакцію може вступати лише одна х-група.

В той  же час зрозуміло, що молекула субстрату  повинна утримуватися в активному  центрі силами зв’язування, яку зумовлюють значну стеричну жорсткість.

До числа  добре вивчених реакцій належить відновлення NAD дегідрогеназами. Використовуючи в якості мітки дейтерій показано, що деякі дегідрогенази каталізують приєднання водню з однієї сторони кільця, а інші – з іншої. Фішер у своїх дослідах використовував етанол мічений дейтерієм по першому атому карбону (CH₃CD₂OH) в якості субстрату для алкагольдегідрогенази, реакція мала наступний вигляд:

Звязки, що з’єднують атоми D та Н з вуглецем кільця NADD, утворюють прямий кут з площиною кільця. Тобто атом Н розміщується під площиною кільця, а атом D – над ним. Так етанол і NAD⁺  розміщуються поруч у активному центрі ферменту і взаємодіють між собою. Одна сторона нікотинамідного кільця повернута до субстрату, а повороту кільця запобігає взаємодія його амідної групи з ферментом; в результаті атоми Н або D з молекули етанолу завжди переходять в певне положення кільця. Як би амідна група бала б відсутня, так що б обидві сторони кільця були еквівалентні, або як  би субстрат міг реагувати із будь-якою стороною кільця,  то у відновленому коферменті атоми D розподілені між двома положеннями і тільки половина дейтерія могла б бути видалена при подальшому ферментативному окисненні. Той факт, що видаляється весь дейтерій демонструє, що він зосереджений в одному положенні. Цікаво, що якщо відновлюється не ферментативним шляхом, а саме гідросульфітом в D₂O, то відновлений кофермент також містить один атом D на молекулу, але він розміщується випадково між двома положеннями. Якщо такий NADD, окислюється потім піруватом при участі лактат дегідрогенази, то видаляється близько половини дейтерія, і це свідчить про те, що для ферментативної реакції необхідне одне положення.