Получение лекарственных препаратов методами биотехнологии

Авторами установлено, что  полученный инсулин по своему строению и биологической активности идентичен  гормону, выделенному из поджелудочной  железы. [13] 
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так получили слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессировался и локализовался в тельцах включения. После выделения белок расщеплялся трипсином с получением инсулина и С-пептида. Другая группа исследователей действовала аналогичным способом. Слитой белок, состоящий из проинсулина и двух синтетических доменов белка А стафилококков, связывающих IgG, локализовался в тельцах включения, но обладал более высоким уровнем экспрессии. Белок выделялся аффинной хроматографией с использованием IgG и обрабатывался трипсином и карбоксипептидазой В. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. Так описано конструирование слитых конструкций, где в качестве полипептида- носителя использовали белок, связывающий сывороточный альбумин человека. К нему присоединяли один, три и семь С-пептидов. С-пептиды соединялись по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показала, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.  
Получение мутанта проинсулина, который содержал замену Arg32Tyr. При совместном расщеплении этого белка трипсином и карбоксипептидазой В образовывался нативный инсулин и С-пептид содержащий остаток тирозина. Последний, после мечения 125I, активно используется в радиоиммунном анализе. [14] 
Очистка инсулина. 
Инсулин, предназначенный для изготовления лекарственных препаратов, должен быть высокой чистоты. Поэтому необходим высокоэффективный контроль за чистотой получаемых продуктов на каждой стадии производства. Ранее с помощью ОФ и ИО (ионообменной) ВЭЖХ были охарактеризованы проинсулин-S-сульфонат, проинсулин, отдельные А- и В-цепи и их S-сульфонаты [13]. Также особое внимание уделяется флуоресцентным производным инсулина [14]. В работе авторы исследовали применимость и информативность хроматографических методов при анализе продуктов всех стадий производства инсулина человека и составили регламент хроматографических операций позволяющий эффективно разделять и охарактеризовывать полученные продукты. Авторы разделяли производные инсулина используя бифункциональные сорбенты (гидрофобная и ионообменная ОФ ВЭЖХ) и показали возможность управления селективностью разделения путем варьирования вклада каждого из взаимодействий, благодаря чему достигается большая эффективность при разделении близких аналогов белка. Кроме того, разрабатываются подходы для автоматизации и ускорения процессов определения чистоты и количества инсулина.

Сообщается об исследованиях  возможности применения ОФ жидкостной хроматографии с электрохимическим  детектированием для определения  инсулина и разработана методика определения инсулина, выделенного  из островка Лангерганса методом  иммуноаффинной хроматографии со спектрометрическим детектированием. В работе  исследовали возможность применения быстрого микроопределения инсулина с использованием капиллярного электрофореза с лазерно-флуоресцентным детектированием. Анализ выполняется путем добавления к пробе известного количества инсулина, меченного фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) и фрагмента Fab моноклональных антител на инсулин. Меченый и обычный инсулины конкурентно вступают в реакцию образования комплекса с Fab. Меченый ФИТЦ инсулин и его комплекс с Fab разделяют за 30 секунд. [12] 
 
В последнее время большое количество работ посвящено усовершенствованию способов получения инсулина, а также созданию лекарственных форм на его основе. Например, в США запатентованы гепатоспецифические аналоги инсулина, структурно отличающиеся от природного гормона за счет введения в положения 13 - 15 и 19 А-цепи и в положение 16 В-цепи иных аминокислотных остатков. Полученные аналоги используются в составе различных парентеральных (внутривенных, внутримышечных, подкожных), интраназальных лекарственных форм или имплантации в виде специальных капсул при лечении сахарного диабета. Особо актуальным является создание лекарственных форм вводящихся без инъекций. Сообщается о создании макромолекулярной системы перорального применения, представляющей собой инсулин иммобилизованный в объеме полимерного гидрогеля, модифицированного ингибиторами протеолитических ферментов. Эффективность такого препарата составляет 70-80 % от эффективности подкожно введенного нативного инсулина. В другой работе лекарственный препарат получают одноэтапной инкубацией инсулина с эритроцитами, взятыми в соотношении 1-4:100, в присутствии связывающего агента. Авторы сообщают о получении лекарственного препарата с активностью 1000 ед./г., полном сохранении активности при пероральном введении и хранении в течение нескольких лет в лиофилизированном виде.  
 
Кроме создания новых лекарственных препаратов и лекарственных форм на основе инсулина, разрабатываются новые подходы к решению проблемы сахарного диабета. Так, трансфицировали кДНК белка переносчика глюкозы GLUT2 предварительно стабильно трансфицированные полноразмерной кДНК инсулина клетки НЕР G2 ins. В полученных клонах НЕР G2 Insgl глюкоза стимулирует близкую к нормальной секрецию инсулина и потенцирует секреторный ответ на другие стимуляторы секреции. При иммуноэлектронной микроскопии в клетках обнаружены содержащие инсулин гранулы, морфологически сходные с гранулами в b-клетках островков Лангерганса. В настоящий момент серьезно обсуждается возможность применения для лечения сахарного диабета 1 типа "искусственной b-клетки", полученной методами генной инженерии. [12] 
 
Наряду с решением практических проблем изучаются и механизмы действия инсулина, а также структурно-функциональные отношения в молекуле. Одним из способов исследования является создание различных производных инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств.

Как уже говорилось выше, ряд методов производства инсулина основан на получении данного  гормона в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением до инсулина и С-пептида. В настоящее время для С-пептида  показано наличие биологической  активности, что позволяет использовать его в терапевтических целях  наряду с инсулином. В следующих  статьях этой серии будут рассмотрены  физико-химические и биологические  свойства С-пептида, а также методы его получения.  
Значителен вклад биотехнологии и в промышленное производство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Методы микробиологической трансформации позволили резко сократить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артрита. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacterglobiformis, для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Имеются разработки по получению гормона щитовидной железы тироксина из микроводорослей.[14] 
4. Получение интерферонов, интерлейкинов, факторов крови 
Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфицирование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку. Интерфероны стимулируют деятельность иммунной системы и препятствуют размножению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интерферонов важны с точки зрения их терапевтического применения.[2] 
Получение интерферонов 
Различают a-, b-, g- и e-интерфероны, образуемые соответственно лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани, Т-лимфоцитами и эпителиальными клетками. Наибольшее значение имеют первые три группы. Интерфероны состоят из 146—166 аминокислотных остатков, b - и g-интерфероны связаны с остатками сахаров (гликозилированы). До введения методов генетической инженерии интерфероны получали из донорской крови — до 1 мкг неочищенного интерферона из 1 л крови, т. е. примерно одну дозу для инъекции. 
Известны способы получения лейкоцитарного интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами и другими индукторами.  
Основным недостатком этих способов получения интерферонов являются вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатитов В и С, вируса иммунодефицита и др.[3] 
В настоящее время более перспективным признан способ получения интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию. 
В качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli. 
Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.[5] 
Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 лкультуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli. 
Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 или Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli pINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli pINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, №9, с.1186-1193), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой pINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой pINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.  
Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона. 
Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.[10] 
 
Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).  
 
Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.[11] 
 
В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.  
 
Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии. [11] 
 
Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона. 
 
Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона. 
 
Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка. 
Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем: 
1) Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды. 
2) Полученным продуктом трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.  
3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК.  
4) Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка [4].  
5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека. 
В настоящее время a-, b- и g-интерфероны успешно получают с применением генноинженерных штаммов Е. coli, дрожжей, культивируемых клеток насекомых(Drosophila) и млекопитающих. Генно-инженерные интерфероны могут быть очищены с использованием моноклональных антител.

В случае у- и р-интерферонов предпочтительно применение эукариотических продуцентов, так как прокариоты не гликозилируют белки. Некоторые фирмы, напримерBioferon (ФРГ), используют не генноинженерные мутанты, а культивируемые invitro фибропласты человека. 
 
Интерфероны используются для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловирусом- вирусом, вызывающим опасное поражение сердца, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание аэрозоля интерферонов позволяет предупредить развитие острых респираторных заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то что интерфероны, в частности a-интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении интерферонов, необходимом для лечения злокачественных опухолей.[13] 
 
Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди, кожи, гортани, легких, мозга, рассеянной миеломе и саркоме. Два последних заболевания характерны для лиц, страдающих приобретенными иммунодефицитами. Интерфероны полезны также при лечении рассеянного склероза. 
 
Методы генетической инженерии позволяют получать модифицированные Интерфероны. Антивирусная активность интерферонов варьирует при аминокислотных заменах (J. Werenne, 1983). Американская компания CetusCorporation производит b-интер-ферон, в аминокислотной последовательности которого цистеин в положении 17 замещен на серии. Это приводит к повышению терапевтической активности препарата, так как предотвращает наблюдаемое invitro формирование неактивного димера b-интер-ферона за счет дисульфидных связей между остатками цистеина в положении 17. Определенные надежды возлагают на модификацию интерферонов путем получения гибридных молекул (Е. Д. Свердлов, 1984). 

Получение интерлейкинов 
Интерлейкины — сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Интерлейкин-1, образующийся определенной группой лейкоцитов крови — макрофагами, в ответ на введение антигена стимулирует размножение (пролиферацию) Т-хелперов (субпопуляции Т-лимфоцитов), продуцирующих, в свою очередь, интерлейкин-2. Последний вызывает пролиферацию различных субпопуляций Т-лимфоцитов — Т-киллеров, Т-хелперов, Т-супрессоров, а также В-лимфоцитов, продуцентов антител. Под влиянием интерлейкина-2 из Т-лимфоцитов высвобождаются регуляторные белки — лимфокины, активирующие звенья иммунной системы; синтезируются также интерлейкины, основные лечебные средства при иммунных расстройствах, получают путем клонирования соответствующих генов в Е. coll или культивирования лимфоцитов invitro. Английская компания CelltechLtd и японская SakyoCompany предлагают синтезированный генноинженерными бактериями интерлейкин-1 наряду с другим тюлипептидным агентом — фактором некроза опухолей - для лечения ряда опухолевых заболеваний.[4] 
 
Интерлейкины - биологически активные вещества, вырабатывающиеся лейкоцитами и являющиеся посредниками в межклеточных взаимодействиях. Интерлейкины являются главными участниками развития иммунного ответа на внедрение микроорганизмов, формирования воспалительной реакции, осуществления противоопухолевого иммунитета и др. Цитокины, называющиеся интерлейкинами и имеющие номера с 1 по 25, не составляют единую подгруппу цитокинов, а носят общее название "интерлейкины" сложившееся исторически. Интерлейкины могут быть разделены на провоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов, хемокины, отдельные регуляторные цитокины.   В области синтеза интерлейкинов у России есть существенные достижения. Освоен выпуск двух рекомбинантных препаратов: Беталейкина и Ронколейкина. 
 
   Беталейкин - рекомбинантный интерлейкин-1-бета человека (ИЛ-1), выпускается в ГНЦ "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов". Продукция ИЛ-1 в организме осуществляется преимущественно моноцитами и макрофагами. Синтез ИЛ-1 начинается в ответ на внедрение микроорганизмов или повреждение тканей и запускает комплекс защитных реакций, составляющих первую линию обороны организма. Одно из главных свойств ИЛ-1, заключается в его способности одновременно стимулировать функции и увеличивать число лейкоцитов. Это свойство ИЛ-1, связанное с необходимостью восполнения пула лейкоцитов для борьбы с внедрившимися возбудителями, послужило отправной точкой для обоснования использования ИЛ-1 как лекарственного средства.   Основным показанием к применению Беталейкина является токсическая лейкопения II-IV степени, возникающая на фоне химио- и радиотерапии злокачественных опухолей. В качестве иммуностимулятора Беталейкин используется для устранения иммунодепрессии после тяжелых травм, обширных хирургических вмешательств, а также при гнойно-септических и гнойно-деструктивных процессах, хронических септических состояниях.[6] 
 
Ронколейкин - рекомбинантый интерлейкин-2 человека (ИЛ-2), выпускается в ООО "Биотех", г. Санкт-Петербург. ИЛ-2 продуцируется в организме Т-лимфоцитами хелперами и выполняет ключевую роль в процессе инициации и развития иммунного ответа. Препарат стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, активирует их, в результате чего они становятся цитотоксическими, киллерными клетками. При этом простимулированныеИЛ-2 лимфоциты становятся способными уничтожать разнообразные патогенные микроорганизмы и малигнизированные клетки. ИЛ-2 усиливает образование иммуноглобулинов В-клетками, активизирует функцию моноцитов и тканевых макрофагов. В целом, ИЛ-2 обладает иммуномодулирующим действием, направленным на усиление противобактериального, противовирусного, противогрибкового и противоопухолевого иммунного ответа.  
 
 Ронколейкин применяется в первую очередь в комплексном лечении сепсиса и тяжелых инфекционно-воспалительных процессов различной локализации (перитонитов, эндометритов, абсцессов, менингитов, медиастенитов, остеомиелитов, панкреатитов, паранефритов, пиелонефритов, пневмоний, плевритов, сальпингитов, флегмон мягких тканей) а также, ожоговой болезни, туберкулеза, хронического гепатита С, микозов, хламидиоза, хронического рецидивирующего герпеса.   

Ронколейкин в качестве противоопухолевого средства применяется для лечения  рака почки и меланомы. Продолжает изучаться эффективность препарата  в лечении рака мочевого пузыря, колоректального рака III-IV стадии, опухолей головного мозга, злокачественной  диссеминированной меланомы кожи, злокачественных  новообразований молочных желез, рака предстательной железы, яичников.    В России в 1993 голу был зарегистрирован аналогичный Ронколейкину американский препарат Пролейкин, маркетинг и продажу которого в нашей стране осуществляла итальянская фирма CSC. Стоимость этого препарата была в 20 раз выше стоимости отечественного Ронколейкина, при этом он давал тяжелые побочные эффекты и имел только одно показание - метастазирующий рак почки. Данный препарат был снят с продвижения в России в 2000 году.    Проводятся доклинические испытания рецепторного антагониста интерлейкина 1 ("Арил", ГНЦ "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов") и рекомбинантного интерлейкина 8 (препарат "Окталейкин"). [1] 
 
Получение факторов крови 
Получаемые биотехнологическим путем факторы свертывания крови, особенно фактор VIII (с помощью культивируемых клеток млекопитающих) и фактор IX (с помощью генно-инженерного штамма Е. coli),необходимы для терапии форм гемофилии наследственной болезни, при которой кровь теряет способность свертываться. К числу ценных с клинической точки зрения факторов, полученных в биореакторах с культурами животных клеток, следует отнести фактор роста В-лимфоцитов, фактор активации макрофагов, Т-заместительный фактор, активатор тканевого плазминогена.[8] 
 
Гемофилия - это генетически заболевание системы свертывания крови. Имеется 2 типа гемофилии: при гемофилия А имеется дефицит фактора VIII, при гемофилии В - дефицит фактора IX. Частота распространения гемофилии А составляет 1 случай на каждые 10 тысяч мужского населения. Гемофилия В встречается в 5 раз реже гемофилии А. Основным методом лечения является внутривенное введение этим больным соответствующих факторов свертывания крови. Это может быть достигнуто путем введения цельной крови, плазмы, криопреципитата или чистых концентратов факторов VIII и IX. 
 
В России зарегистрированы два импортных препарата рекомбинантного фактора VIII - Рекомбинат и Когенэйт ФС, а также активированный рекомбинантный фактор коагуляции VIIа - НовоСэвен.Отечественного рекомбинантного фактора VIII нет. Плазматический (не рекомбинантный) фактор VIII представлен импортными препаратами Иммунат, Коэйт ДВИ, Октанат, Монарк-Ф, Гемофил-Ми отечественным криопреципитатом. 
 
Рекомбинантный фактор IX создан в США в 1998 г и в России до настоящего времени не зарегистрирован. В нашей стране могут быть использованы только концентраты фактора IX, получаемых из крови доноров импортного (Конайн 80, Иммунин, Октанайн, Уман Комплекс Д.И.) и отечественного (Агемфил В) производства.[9] 
 
5. Моноклональные антитела и ДНК- или РНК- пробы 
Моноклональные антитела — продукты В-гибридомных клеток  — используют для диагностики различных заболеваний.