Особливості біосинтезу лимонної кислоти

Міністерство  освіти і науки України  

  Національний авіаційний університет

Інститут  заочного та дистанційного навчання 
 
 
 
 
 
 
 

Домашня контрольна робота

З дисципліни:

«Мікробіологія  біологічних агентів»

на тему:

Особливості біосинтезу лимонної кислоти. 
 
 
 
 

Виконала: студентка 4 курсу

Аншутіна  А.С.

Прийняла: Попова Е.М. 
 
 
 
 

Київ 2011

Зміст

    Вступ

1. Опис об'єкту дослідження…………………………………………………….4

1.1. Хімічні і фізичні властивості лимонної кислоти………………………….4

1.2. Продуценти лимонної кислоти……………………………………………..5

2. Властивості сировини для біосинтезу лимонної кислоти…………………..6

3. Спосіб культивування…………………………………………………………7

4. Характеристика готової лимонної кислоти…………………………………..9

5.Застосування лимонної кислоти……………………………………………...12

     Висновок

     Список використаної літератури 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

         Вступ 

    Лимонна кислота є основним з підкислювачів. Її частка становить близько 75% обсягу з всіх вироблених підкислювачів. Особливо широко вона використовується у виробництві безалкогольних напоїв, яким надає фруктові і ягідні запахи і смак. 4 г лимонної кислоти відповідає соку одного середнього лимона.

    Розширюється сфера застосування лимонної кислоти в технічних цілях - в хімічній, текстильній, шкіряній, металургійній та інших галузях промисловості. Попит на лимонну кислоту безперервно зростає, але в колишніх соціалістичних країнах він задовольняється вкрай слабко, тому в даний час організовуються нові виробничі потужності з випуску цього цінного продукту. Лимонна кислота була виділена вперше в 1784 році шведським аптекарем Карлом Шеєле із соку недозрілих лимонів. В кінці 1970-х років у Західній Європі набула поширення містифікація, відома як «вільжюіфский список», в якому лимонна кислота була названа сильним канцерогеном.

     Лимонну кислоту виробляють головним чином шляхом мікробного синтезу, який є важливою галуззю біотехнології. Ця робота присвячена мікроорганізмам продуцентам лимонної кислоти і сучасним досягненням біотехнології в області біосинтезу органічних кислот. Описані теоретичні основи мікробного синтезу і механізми регуляції біосинтезу органічних кислот, їх зв'язок із загальною фізіологією мікробних клітин. У роботі висвітлено багаторічний досвід авторів у промисловому біосинтезі органічних кислот.

     
 
 
 

1. Опис об'єкту дослідження 

1.1. Хімічні і фізичні властивості лимонної кислоти 

    Лимонна кислота НООС-СН2С (ОН) - СООН-СН2-СООН є моноокситрикарбоновою кислотою, яка кристалізується з водних розчинів з однією молекулою води (моногідрат лимонної кислоти) у вигляді безбарвних прозорих ромбоподібних кристалів. Моногідратна лимонна кислота має молекулярну масу 210, густину 1,540 г/см3 і температуру плавлення 70-750С. Кристалізаційна вода втрачається при зберіганні та інтенсивно виділяється при температурах, що перевищують 40-50°С. При 100°С вода втрачається повністю.При температурі кристалізації 36,6°С і вище виділяється безводна лимонна кислота з молекулярною масою 192 і температурою плавлення 153°С. При нагріванні до 175°С лимонна кислота розкладається.[1]

Рис.1. Хімічна формула лимону C6H8O7. 

    Лимонна кислота добре розчиняється у воді (1460 г/л при 20°С) і помірно - в етанолі (620 г/л при 25°С).

    Солі лимонної кислоти - цитрати - мають низьку водорозчинність.Лимонна кислота широко поширена в природі. Особливо багато її в незрілих фруктах і ягодах (лимони, журавлина, яблука, виноград, та ін), де лимонна кислота є природним консервуючим агентом.

Рис.2. Кристали лимонної кислоти, підсвічені поляризованим світлом, в двохсоткратному збільшенні. 

1.2. Продуценти лимонної кислоти 

     Після перших публікацій К. Вемера про здібності мікроміцетів синтезувати органічні кислоти, у тому числі лимонну, багато мікробіологів стали ретельно вивчати фізіологію грибів та їхні біосинтетичні здібності. Численні досліди вказали на явно виражений потенціал гіперсинтезу лимонної кислоти у цілого ряду мікроміцетів, дріжджових грибів і бактерій.   Залежно від хімічної природи окислюваного субстрату (бурякова, очеретяна, цитрусова або фінікова меляса, сік цукрового очерету, гідрол, гідролізати крохмалю, вижимки, сахароза, глюкоза, парафіни і багато інших субстратів) в якості продуцентів лимонної кислоти у більш-менш широких масштабах використовують мікроміцети, що належать до родів Aspergillus, Penicillium, Trichoderma і Botrytis, дріжджові гриби родів Candida, Delaromyces і Torulopsis, а також бактерії родів Arthrobacterium, Pseudomonas та Micrococcus.Детально вивчені численні представники аспергилів, особливо Aspergillus awamori, A. aureus, A. clavatus, A. glaucus, A. niger.

    Самим широко поширеним продуцентом лимонної кислоти є мікроміцети Aspergillus niger, фізіологія і механізм біосинтезу лимонної кислоти якого найбільш вивчені.[2] 

2. Властивості сировини для біосинтезу лимонної кислоти 

     В даний час для біосинтезу лимонної кислоти в якості основної сировини широко використовують мелясу - відходи цукрової промисловості. У залежності від вихідного матеріалу розрізняють бурякову, очеретяну, цитрусову та інші види меляси. На міжнародному ринку щорічно продається 30-35 млн. тонн цієї сировини. Хоча меляса в основному використовується для кормових цілей, її широко застосовують також у мікробіологічній промисловості.

    Бурякова меляса характеризується високим вмістом цукрів (46-55%), з яких переважає сахароза. Меляса має складний та непостійний хімічний склад. Вона містить колоїди, органічні кислоти, вітаміни, білки і вільні амінокислоти, складний спектр мінеральних речовин. З нелетких органічних кислот в мелясі можуть присутні,%: лимонна - 0,01-0,5; глюконова - 0,5-1,0; яблучна - 0,1-0,5; бурштинова - 0,1-0,7.Добре зброджувана меляса повинна містити не більше 1% інвертного цукру і не більше 1% СаО і 0,06,% сірчистого газу (додається в мелясу в якості консервуючого агента) при загальному вмісті сухих речовин не менше 75% і цукрів не менше 46,% при невисокому вмісті живих мікроорганізмів.

    У золі бурякової меляси багато калію, магнію, заліза, але відносно мало фосфору. Хімічний склад меляси залежить від кліматичних і грунтових умов вирощування цукрових буряків, застосовуваних мінеральних добрив, часу збирання врожаю (пізні терміни збирання негативно впливають на якість меляси), технологічних нюансів переробки цукрових буряків, умов транспортування та зберігання меляси.

    Виробництво меляси пов'язано з сезонними доставками сировини. У виробництві лимонної кислоти найкращі результати дає зріла, витримана меляса. Важливе значення мають тривалість зберігання меляси та наявність герметично закритих ємностей - мелясосховищ з пневматичним перемішуванням (для запобігання розшарування), насосами, пристроями для подачі і забору меляси з різних горизонтальних сховищ. В останнє десятиліття якість меляси погіршується під впливом ряду додаткових чинників, пов'язаних з технічним прогресом. Широко застосовувані в сільському господарстві отрутохімікати і мінеральні добрива можуть залишати певні негативні сліди в сільськогосподарській продукції, зокрема в мелясі, де виявлені інсектициди, наприклад фосфорорганічний інсектицид малатілон (до 90 мг на 1 кг меляси), який надає інгібуючий вплив на біосинтез лимонної кислоти.

    У мелясі виявлено присутність деяких фунгіцидів (трилон, мертрілан та ін.). Дані про вплив фунгіцидів на біосинтез лимонної кислоти неоднозначні. Деякі автори стверждують, що ряд фунгіцидів пригнічує активність ферментів ізоцитрат-і сукцинатдегідрогенази і тим самим сприяє біосинтезу лимонної кислоти, в усякому разі у диких культур Aspergillus niger. За даними інших авторів, фунгціди негативно впливають на ацидогенез. Виявлено пригнічення синтезу білка в клітинах Aspergillus niger під дією ртутьорганічного фунгіциду мертрілана. У результаті його впливу на ферменти циклу трикарбонових кислот (зокрема на малат-, ізоцітрат-і сукцинатдегідрогенази) різко знижуються інтенсивність дихання клітин та активність термінальних оксидоредуктаз, особливо цитохромоксидази. Фунгіцид трілан (4,5,6-тріхлорбензоксазолідон) також негативно впливає на метаболізм мікроміцета Aspergillus niger, але механізм його впливу інший.

     Всі досліджені фунгіциди пригнічують інтенсивність дихання, гальмують синтез білка, порушують проникність цитоплазматичних мембран.У мелясі нерідко виявляється присутність детергентів. Їх вплив на мікроорганізми не досить добре вивчено. Встановлено зміну проникності клітинної мембрани Aspergillus niger і як наслідок - підвищена гідроксилазна активність культури. 

3. Спосіб культивування

     Успіхи глибинної ферментації у виробництві антибіотиків спонукали виробників лимонної кислоти шукати шляхи глибинного культивування її продуцентів. У СРСР першою глибинне культивування продуцентів лимонної кислоти освоїла група дослідників під керівництвом Г.І. Журавського в 50-і рр., застосовуючи синтетичні сахарозні середовища і спеціально селекційно виведений для глибинного культивування штам Aspergillus niger. В якості ж сировини для глибинної ферментації лимонної кислоти може бути використаний широкий набір природних субстратів: меляса, глюкоза, сахароза, рідкі парафіни та інші джерела вуглецю. Технологія глибинного культивування продуцентів лимонної кислоти представляє собою явно виражений двоступінчастий процес. Перший ступінь включає вирощування посівного матеріалу з конідіоспор в посівному середовищі (на гойдалці і в посівному апараті) при 32-33°С в умовах інтенсивної аерації (0,8-1,0 об'єму повітря на 1 об'єм середовища в хвилину) і при безперервному перемішуванні середовища. Тривалість культивування на стадії вирощування посівного матеріалу - 2 доби (1 добу - на качалці, 1 - на посівному апараті).

   Сказане принципово не виключає безпосереднього застосування конідіоспор як посівний матеріал для основної ферментації, проте це суттєво подовжує цикл ферментації: з 7-8 до 12-13 діб.Основну ферментацію в глибинних умовах здійснюють у виробничому біореакторі при коефіцієнті його заповнення 0,75-0,80 і кількості посівного матеріалу 5-8% від об'єму ферментного середовища. Початкова концентрація цукрів - 10-14%, часто застосовують підживлення свіжим середовищем, особливо в разі застосування мелясних середовищ. Регуляція рН середовища не потрібна, але оскільки лимонна кислота дуже корозійна і для ферментаційного обладнання необхідна стійка до корозії сталь, то для пом'якшення практикують підлужнення ферментного субстрату до рН 3,8-4,2. Процес ферментації має риси двох фаз, або стадій: формування біомаси та кислотоутворення.

    Для фази накопичення біомаси характерне об'єднання молодого міцелію в кулясті агломерати, формування яких продовжуються до 70-80 год ферментації. Деяка частина гіфів залишається у вільному вигляді. Під час інтенсивного росту потреба продуцента в молекулярному кисні складає до 1 кг на кожен кубометр ферментного субстрату на годину. У фазі біосинтезу лимонної кислоти потреба в кисні в деякій мірі знижується і складає 0,5-0,6 кг 02/м3-год. Для забезпечення масопередачі кисню в ферментний субстрат вводиться стерильне повітря в кількості 0,8-1,0 об'єму на 1 об'єм середовища в хвилину, одночасно за допомогою мішалки створюється циркуляція середовища зі швидкістю 1,2-1,5 м/с вздовж стінки ферментної установки. Насичення середовища киснем у початковій фазі ферментації має складати 20-25% від повного насичення, у фазі біосинтезу лимонної кислоти - 10-15%.

    Температурні режими в ферментних субстратах диференційовані: у фазі росту біомаси - 32-33°С, у фазі кислотоутворення - 30-31°С.Залежно від особливостей використовуваного мутанта Aspergillus niger застосовують різні варіанти технологічних режимів глибинної технології. 

4. Характеристика готової лимонної кислоти 

     Технічне найменування продукту - лимонна кислота (чистота 99,9%). Лимонну кислоту отримують з культуральної рідини при глибинному культивуванні мікроскопічного гриба Aspergillus niger з наступним відділенням біомаси.

     Лимонна кислота за якістю має відповідати показниками, передбаченими ГОСТ 908: 2006. Це повинні бути безбарвні кристали або білий порошок, без грудок, для кислоти I сорту допускається жовтуватий відтінок, смак кислий, без стороннього присмаку, 2% -ний розчин кислоти в дистильованій воді повинен не мати запаху, бути прозорим і не містити механічних домішок, структура - сипка, суха, на дотик не липка, без сторонніх домішок.[2]

    За кордоном лимонну кислоту класифікують за величиною кристалів на ситових апаратах. Велику увагу звертають на легкообуглювані речовини, що дають забарвлення при нагріванні протягом певного часу з концентрованою сірчаною кислотою при температурі 90°С. Вони викликаються слідами органічних сполук - цукру, оксиметилфурфурола, інших альдегідів і спиртів, за винятком цис-і трансаконітової, ізолимонної, щавлевої, янтарної і олеїнової кислот, ерттріту, ксиліту і сорбіту.

     Для видалення легкообуглюваних речовин запропоновано багато способів: виділення цитрату кальцію в присутності 10% пероксиду водню до кількості лимонної кислоти; нагрівання до кипіння розчинів лимонної кислоти після відділення гіпсу в поєднанні з обробкою пероксидом водню; додавання до розчину лимонної кислоти перед кристалізацією борної кислоти в кількості 0,1-0,3% за масою розчину, екстракція фреоном та ін.