Механизм формирования третичной структуры ферментов

Вероятность агрегации сильно возрастает при повышении температуры  и концентрации белка, поэтому эффективное  спонтанное сворачивание полипептидной  цепи происходит в разбавленных растворах  и при низких температурах. Условия, существующие в клетке, сильно отличаются по этим параметрам. И вместе с тем, в физиологических условиях вновь  синтезируемые полипептидные цепи сворачиваются достаточно быстро и  эффективно. Следовательно, в клетке должны существовать специальные механизмы  регуляции процесса сворачивания. Согласно современным представлениям, клетка располагает, по крайней мере, двумя типами механизмов регуляции формирования пространственной структуры белка:

1. основан на регуляции скорости превращения «расплавленной глобулы» в нативную структуру;
2. обеспечивает защиту частично свернутого белка от неспецифической агрегации.

 

2.2 Свойства нативной конформации

 

Нативная конформация белка обладает рядом свойств:

1. По всем тестам она ведет себя как самая стабильная из всех кинетичски существующих процессов сворачивания белка;
2. Не существует ни каких гарантий, что нативная структура является термодинамически самой стабильной;
3. Процесс сворачивания идет по принципу более быстрого достижения минимума свободной энергии полипептидной цепи. Таким образом установлено, что не термодинамика, а кинетика определяет форму белка;
4. Пространственная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью в первичной структуре. Эта последовательность запрограммирована генетическим кодом.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания

 

 

Сворачивание полипептида  в клетке сопровождается ферментативными  модификациями цепи. Деформилаза отщепляет формильную группу концевого метионина вскоре после выхода N-конца растущей цепи из рибосомы. Аминопептидаза способна отщеплять N-концевой метионин. Мембранная сигнальная пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Несколько ферментов принимают участие в гликозилировании белка.

Как уже отмечалось, стадия превращения «расплавленной глобулы» в нативный белок является самой медленной, ограничивающей скорость всего процесса. Это обусловлено тем, что установление «оптимального набора» специфических взаимодействий, стабилизирующих нативную конформацию, связано с необходимостью структурных перестроек, происходящих относительно медленно. К их числу относится цис-транс-изомеризация пептидной связи, предшествующей остатку пролина. Поскольку транс-конформация более стабильна, она преобладает во вновь синтезированной полипептидной цепи. Однако для образования нативной структуры белка необходимо, чтобы около 7% связей, образованных остатками пролина, изомеризовались в цис-конформацию. Эта реакция, приводящая к повороту цепи на 180° вокруг C-N связи, идет чрезвычайно медленно. In vivo она ускоряется благодаря действию специального фермента - пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 4 – Фермент пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы.

Второй фермент, ускоряющий процесс сворачивания, катализирует образование и изомеризацию дисульфидных связей. Он локализуется в просвете эндоплазматического ретикулума и способствует сворачиванию секретируемых клетками белков, содержащих дисульфидные мостики (например, инсулин, рибонуклеаза, иммуноглобулины)

Рисунок 5 – Протеин  дисульфидизомераза

Характерная особенность  обоих ферментов состоит в  том, что они не способны связываться  с нативными белками; их субстраты имеют частично развернутую структуру, близкую к состоянию «расплавленной глобулы». Ускоряя стадии, лимитирующие скорость сворачивания, ферменты способствуют удержанию белка на правильном пути приобретения нативной структуры, снижая риск протеолитической деградации и агрегации лабильных промежуточных форм.

 

 

3.1 Шапероны и шаперонины

 

 

Кроме ферментов в формировании пространственной структуры белка  участвуют специальные белки, увеличивающие  эффективность сворачивания полипептидной  цепи в нативную конформацию. В середине 80-х годов началась новая эра в исследовании механизмов регуляции сворачивания белков in vivo. Было обнаружено, что в клетке существует особая категория белков, основной функцией которых является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру. Эти белки, связываясь с развернутой или частично развернутой конформацией полипептидной цепи, не дают ей «запутаться», образовать неправильные структуры. Они удерживают частично развернутый белок, способствуют его переносу в разные субклеточные образования, а также создают условия для его эффективного сворачивания. Эти белки получили название «молекулярные шапероны», образно отражающее их функцию (chaperon - пожилая дама, сопровождающая молодую девушку на балы и пр., наставник, сопровождающий группу молодежи). К настоящему времени описано несколько классов шаперонов, различающихся по структуре и специфическим функциям. Все шапероны являются так называемыми «белками теплового шока», синтез которых резко увеличивается в стрессовых для клетки ситуациях. Поэтому сокращенное название этих белков - hsp (heat shock proteins). Однако и в нормальных условиях каждая клетка содержит определенный набор шаперонов, необходимых для ее жизнедеятельности. Классификация шаперонов основана на величине молекулярной массы составляющих их субъединиц, которая варьирует от 10 кДа (hsp10) до 90 кДа (hsp90) и выше. По характеру выполняемых этими белками функций их можно разделить на два больших семейства - шапероны, или hsp70, и шаперонины, к которым относятся hsp60 и hsp10.

 

Рисунок 6 – Функция шаперонов в клетке.

Шапероны удерживают белки в развернутом состоянии. Взаимодействие шаперонов с синтезируемым белком начинается еще до схождения полипептидной цепи с рибосомы. Связываясь с отдельными участками «опекаемой» ими полипептидной цепи, молекулы hsp70 образуют прочные комплексы, удерживающие цепь в развернутом состоянии. Взаимодействие не является специфическим и в основном реализуется благодаря силам гидрофобного характера. Прочно фиксированная на шаперонах полипептидная цепь не способна к сворачиванию в нативную структуру, так как не обладает необходимой для этого подвижностью. Главная функция hsp70 состоит в удержании вновь синтезируемых белков от неспецифической агрегации и в их передаче другому «белку-помощнику», шаперонину, роль которого - обеспечить оптимальные условия для эффективного сворачивания.

В клетках эукариот шапероны выполняют также важную роль в транспорте белков через мембраны митохондрий хлоропластов и эндоплазматического ретикулума. Такой транспорт необходим, так как многие белки клеточных органелл синтезируются в цитоплазме, а окончательно сворачиваются в месте своей постоянной локализации. Роль hsp70, «подносящего» к мембране частично развернутый белок, становится понятной, если учесть, что разворачивание - обязательное условие проникновения белковой молекулы через мембрану. Интересно, что митохондриальный матрикс содержит собственные шапероны, «подхватывающие» пересекающий мембрану белок и способствующие его «втягиванию» в митохондрию. Аналогичный механизм реализуется и при проникновении синтезированных в цитоплазме белков в просвет эндоплазматического ретикулума.

Возникает вопрос: от чего же зависит прочность связывания шаперона с полипептидной цепью? Каков механизм, позволяющий развернутому белку освободиться от hsp70 и перейти на шаперонин (hsp60)? Детальные исследования, проведенные на системах белков, выделенных из клеток бактерий, показали, что главным фактором является способность шаперона связывать АТФ, в определенных условиях осуществлять его гидролиз и изменять прочность взаимодействия с полипептидной цепью в зависимости от природы связанного нуклеотида (АТФ или АДФ). С многодоменными белками в клетке работают «большие» шапероны, или шаперонины типа GroEL и GroES или TriC. В отличие от довольно просто построенных шаперонов (состоящих из одной-двух полипептидных цепей), шаперонины представляют собой сложные олигомерные структуры.

Рисунок 7 -  Структура шаперонина hsp60.

 Наиболее изученные hsp60 митоходрий, а также клеток E. coli, построены из 14 субъединиц, организованных в два семичленных кольца, лежащих одно под другим. В центре построенного таким образом цилиндра имеется полость - канал (диаметром 45 ангстрем), в котором и происходит сворачивание полипептидной цепи, перешедшей на шаперонин с шаперона hsp70. Иногда такую «пробирку» называют «ячейкой Анфинсена». После того как в канал молекулы шаперонина попадает полипептидная цепь, вход прикрывает hsp10 - белковое кольцо, построенное из 7 субъединиц.

Создав шаперонины, природа нашла элегантный способ обеспечить сворачивание белка в условиях, исключающих его агрегацию с другими белками внутри клетки. Действительно, попадая в центральный канал молекулы шаперонина, единичная полипептидная цепь оказывается полностью изолированной и получает возможность реализовывать медленные стадии сворачивания с очень высоким выходом нативного белка. Как и в случае hsp70, связывание развернутого белка с шаперонином и его отщепление регулируются АТФ-азной активностью шаперонина. В связывании сворачивающегося белка (находящегося в состоянии «расплавленной глобулы») может принимать участие каждая из 14 субъединиц олигомерной молекулы шаперонина. Количество мест связывания зависит от стадии сворачивания: чем ближе структура к нативной, тем меньше участков, «распознаваемых» шаперонином. Роль маленького шаперонина hsp10, называемого ко-шаперонином, закрывающего вход в центральный канал, состоит в том, чтобы предотвращать «преждевременный» выход во внешнюю среду белка, не завершившего окончательное сворачивание в нативную структуру.

Рисунок 8 - Модель сворачивания белков с участием шаперонинов.

 Овальными фигурами обозначены структурные состояния шаперонина hsp60 с сильным сродством к развернутому белку, прямоугольными фигурами - состояния, в которых шаперонин такой белок не связывает. Вверху показан hsp10, который диссоциирует по окончании сворачивания. 1- белок в состоянии «расплавленной.глобулы» связывает гидрофобные участки «стенок» центрального канала молекулы шаперонина. Это взаимодействие стимулирует присоединение АТФ, в результате которого структура шаперонина меняется (гидрофобные участки «стенок» экранируются), и белок освобождается, переходя в центральный канал. Спонтанное сворачивание будет продолжаться до тех пор, пока не произойдет гидролиз АТФ и переход шаперонина в состояние, способное связывать частично развернутый белок. Стадии 1, 3, 5 различаются количеством «развернутых» участков структуры белка, взаимодействующих со «стенками» центрального канала. Стадия 7:- нативный белок, не способный связываться с шаперонином, выходит наружу.

Данная модель дает лишь самое общее представление о  механизмах функционирования шаперонинов. Она основана на изучении этих белков, изолированных из митохондрий или бактериальных клеток. Между тем, недавно было выяснено, что цитоплазматический шаперонин клеток эукариот весьма существенно отличается по своим свойствам: он построен из неодинаковых субъединиц и, по-видимому, не взаимодействует с ко-шаперонином. Вероятно, что общие принципы функционирования, установленные для hsp60, распространяются и на этот шаперонин, однако конкретные механизмы, вовлеченные в регуляцию эффективности сворачивания белков в разных компартментах клетки, могут существенно различаться.

 

 

 

 

Заключение

 

 

Процесс сворачивания белка в третичную конформацию многостадийный. В первую стадию сворачивания идет процесс формирования элементов вторичной структуры. Таким образом, альфа – спираль – стартовая структура. С точки зрения термодинамики процесс её формирования наиболее выгодный, то есть минимум энергии и минимум времени. Бетта- структура формируется из первичной развернутой структуры медленно. Вторая стадия – «очень быстрая» происходит образование специфических ассоциаций элементов вторичной структуры, образуются супервторичные структуры. Третья стадия медленная. В этот момент формируются расплывчатые глбулы, тут формируется гидрофобное ядро. Четвертая стадия, последняя, окончательное формирование нативной структуры белка, белки принимают ту структуру, которую они имеют.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемых источников

 

 

1) Бендер М. Биоорганическая химия ферментативного катализа пер с английского/ М. Бендер, Р. Бергерон. – М.:Мир, 1987 – 352с.

2) Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. – М.: Просвещение, 1987 – 815 с.

3) http://www. biochem.bio.msu.ru

4) http://www. distedu.ru