Механизм формирования третичной структуры ферментов

Содержание

 

 

Введение. 2

1 Парадокс Левенталя 3

2 Стадии сворачивания  белка.. 5

2.1 Иерархический принцип  сворачивания. 6

2.2 Свойства нативной конформации 8

3 Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания. 10

3.1 Шапероны и шаперонины 11

Заключение. 15

Список используемой литературы 16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

 

Синтезируемые в клетке полипептидные  цепи, образованные в результате последовательного  соединения аминокислотных остатков, представляют собой как бы полностью  развернутые белковые молекулы. Для  того, чтобы белок приобрел присущие ему функциональные свойства, цепь должна определенным образом свернуться в пространстве, сформировав функционально активную ("нативную") структуру. Несмотря на громадное число теоретически возможных для отдельной аминокислотной последовательности пространственных структур, сворачивание каждого белка приводит к образованию единственной нативной конформации. Таким образом, должен существовать код, определяющий взаимосвязь между аминокислотной последовательностью полипептидной цепи и типом пространственной структуры, которую она образует.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Парадокс Левенталя

 

 

Несмотря на громадное  число теоретически возможных для  отдельной аминокислотной последовательности пространственных структур, сворачивание каждого белка приводит к образованию  единственной нативной конформации. Таким образом, должен существовать код, определяющий взаимосвязь между аминокислотной последовательностью полипептидной цепи и типом пространственной структуры, которую она образует.

Загадочность самоорганизации  белков (и РНК) суммируется «парадоксом  Левинталя». Загадка состоит вот в чем. У белковой цепи есть бездна возможных конформаций (каждый аминокислотный остаток имеет около 10 возможных конформаций, то есть цепь из 100 остатков - порядка 10¹⁰⁰ возможных конформаций). Так что белок должен искать «свою» пространственную структуру среди порядка 10¹⁰⁰ И так как переход из одной конформации в другую занимает ∼10^-13 секунды как минимум, «тупой» перебор всех 10¹⁰⁰ структур должен был бы занять порядка 10⁸⁰ лет, на фоне которых время жизни нашей Вселенной - - 10¹⁰ лет - величина бесконечно малая... Вопрос: как белок может «найти» свою структуру за минуты? Парадокс же заключается в следующем. С одной стороны, нативная пространственная структура по всем тестам ведет себя как самая стабильная из всех существующих структур цепи: белковая цепь попадает в нее при разных кинетических процессах [и при сворачивании на рибосоме в процессе биосинтеза, и после секреции сквозь мембрану, и при сворачивании в пробирке (ренатурации), - чем бы и как бы она ни была в этой пробирке развернута]. С другой стороны, нет никаких гарантий, что эта структура - самая стабильная из всех возможных: у белковой цепи просто нет времени на то, чтобы убедиться в этом! Как же белок выбирает свою нативную структуру среди бесчисленного множества возможных? - спросил Сайрус Левинталь, и ответил: - По-видимому, самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному «пути сворачивания», и та структура, где этот путь заканчивается, и является его нативной структурой.

Иными словами, Левинталь предположил, что нативная структура белка определяется не стабильностью, не термодинамикой, а кинетикой, т.е. она соответствует не глобальному, а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи. Вопрос о том, что именно - кинетика или термодинамика - определяет укладку белковой цепи - отнюдь не чисто умозрительный. Он постоянно возникает на пути решения конкретных задач физики белка, - идет ли речь о предсказании структуры белка по его аминокислотной последовательности (надо знать, что предсказывать: самую стабильную или самую быстро сворачивающуюся его структуру), или о дизайне новых, не встречающихся в природе белков (надо знать, что делать: максимально усиливать стабильность желаемой структуры или пролагать максимально быстрый путь к ней). Решение «парадокса Левинталя» состоит в том, что к стабильной структуре цепи автоматически ведет сеть быстрых путей сворачивания. Для этого необходимо только, чтобы между нативной укладкой цепи и прочими ее глобулярными укладками существовала бы заметная энергетическая щель.

И так, образование пространственной структуры - процесс спонтанный, не требующий ни дополнительной информации, ни источника энергии. Структуру  белка определяет его аминокислотная последовательность (а значит генетический код), а не работа сложных синтезирующих  машин в клетке. Основная задача всех внутриклеточных приспособлений и помощников - оберегать сворачивающийся  белок от нежелательных контактов, которых было бы не избежать без  строгого ока «воспитателей». Строго говоря, белок способен к спонтанной самоорганизации и ренатурации, только если он не подвергся сильной пост-трансляционной модификации - т.е. если его химическая структура не была сильно нарушена после биосинтеза. Например, инсулин (где половина цепи вырезается уже после того, как он свернулся) не способен к ренатурации. Пост-трансляционные модификации бывают самые разные. Как правило, химические модификации контролируются специальными ферментами, а не «самоорганизуются» в самом белке. Кроме расщепления белковой цепи, наблюдается модификация концов цепи, ацетилирование, гликозилирование, пришивание липидов в определенные точки цепи, фосфорилирование определенных боковых групп, и т.д., и т.п. Недавно был обнаружен даже «сплайсинг» белковых цепей (спонтанное вырезание куска цепи и склейка образовавшихся при этом концов). Изредка наблюдается и спонтанная циклизация кусочков белковой цепи.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Стадии сворачивания  белка

 

 

Рассмотрим как происходит процесс сворачивания белка в клетке. Полипептидная цепь строится путем последовательного роста на рибосоме от N-конца к С-концу. Факторы, определяющие сворачивание N-концевой части растущего пептида будут различны в зависимости от того насколько удален рассматриваемый участок от фиксированного С-конца. Можно рассмотреть 3 различные ситуации, в которых оказываются аминокислотные остатки растущего пептида:

1. В пептидилтрансферазном центре рибосомы 2 аминокислотных остатка всегда находятся в однотипной ориентации по отношению друг к другу, соответствующей альфа-спиральной конформации;
2. Участок растущего пептида длиной 30 - 40 остатков все еще оказывается закрытым рибосомой. Наиболее вероятной его конформацией при этом является α-спираль;
3. Пептидная цепь, удаленная от пептидилтрансферазного центра далее 30 - 40 аминокислотных остатков погружается в цитоплазму или мембрану эндоплазматического ретикулума. Однако и здесь ситуация отлична от спонтанной ренатурации in vitro.

Во-первых, сворачивание начинается со стартовой конформации, поддерживаемой рибосомой. Во-вторых, поиск путей сворачивания идет последовательно с растущего N-концевого участка. В-третьих, в процессе сворачивания С-конец фиксирован. То, что сворачивание пептида происходит ко-трансляционно, подтверждает например синтез бета-галактозидазы. Ферментативная активность этого белка требует формирования четвертичной структуры. Оказалось, что растущая цепь, еще до своего завершения, будучи присоединенной к рибосоме, уже способна ассоциировать со свободными субъединицами белка, и комплекс на рибосоме проявляет ферментативную активность. Кроме того, рибосомы, несущие растущие цепи β-галактозидазы, реагируют с антителами против готового фермента еще задолго до завершения трансляции мРНК. Другими словами, рибосома может способствовать определенному пути сворачивания. Благодаря существующей внутри клетки высоко координированной системе регуляции, полипептидная цепочка с самого момента своего «рождения», сходя с рибосомы, попадает под контроль факторов, которые, не изменяя специфического пути сворачивания (определяемого генетическим кодом), обеспечивают оптимальные условия для реализации быстрого и эффективного образования нативной пространственной структуры. Не смотря на «избранный» путь, определенный рибосомой, те же пространственные структуры белков получаются и после транслокации более или менее развернутой цепи через мембрану, и in vitro, при сворачивании (ренатурации) целой белковой цепи из развернутого состояния. Это значит, что детальная последовательность действий не играет решающей роли при сворачивании белка.

Образование пространственной структуры белка - процесс многостадийный. Способность того или иного участка  полипептидной цепи образовывать элемент  вторичной структуры (например, свернуться в α-спираль) зависит от характера аминокислотной последовательности данного отрезка цепи. Таким образом, число и расположение α -спиралей, β-тяжей и петель по ходу полипептидной цепи различно у разных белков и определяется генетическим кодом. Этим объясняется потенциальная способность любой полипептидной цепи к спонтанному сворачиванию в уникальную третичную структуру.

 

2.1 Иерархический  принцип сворачивания

 

Согласно современным  представлениям, процесс сворачивания имеет иерархическую природу:

1. Очень быстрое формирование элементов вторичной структуры, служащих как бы «затравками» для образования более сложных архитектурных мотивов (за десятую долю микросекунды альфа-спираль охватывает пептид из 20-30 остатков);

Рисунок 1 – Формирование элементов вторичной структуры

2. Специфическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры: сочетания нескольких α-спиралей, нескольких β-цепей либо смешанные ассоциаты данных элементов (тоже очень быстрая стадия);

Рисунок 2 - Специфическая ассоциация некоторых элементов вторичной структуры с образованием супервторичной структуры.

3. Формирование «расплавленной глобулы» (создание основных элементов третичной структуры - сочетание α-спиралей, β-тяжей, соединяющих петель и образование гидрофобного ядра молекулы);
4. Формирование нативной структуры белка .

Рисунок 3 – Формирование нативной конформации белка.

Таким образом, α-спираль можно рассматривать как стартовую структуру при сворачивании полипептидной цепи в нативную конформацию. В развернутой цепи белка α-спираль термодинамически является наиболее вероятной структурой. Полипептидная цепь с любой аминокислотной последовательностью может быть свернута в α-спираль без нескомпенсированной потери водородных связей. Даже остатки пролина могут быть введены во внутренние витки спирали с незначительными искажениями структурных параметров классической α-спирали. Дальнейшее формирование элементов третичной структуры осуществляется плавлением концов α-спиралей и контролируется первичной структурой как расплавленного участка, так и, по крайней мере, концевого витка спирали. Другими словами, пространственная структура белка закодирована распределением аминокислотных боковых цепей на поверхности α-спирали. В отличие от α-спирали, β-структура в развернутой цепи формируется крайне медленно. Время ее формирования составляет секунды и более.  Однако, описанный здесь иерархический принцип сворачивания нельзя считать догмой. Например, Финкельштейн говорит: «Все спекуляции о специфических (например, иерархический) принципах сворачивания белка (которые выглядели так привлекательно и сулили существенно упростить поиск нативной структуры) оказались неверными». Так что если вы найдете какую-то другую теорию, мы с удовольствием обсудим ее на семинаре. А сейчас поговорим о том, почему белок сворачивается?

Любой процесс может протекать  самопроизвольно, только если ΔG < 0. Движущей силой процесса может быть либо уменьшение энтальпии, которое происходит при  образовании связей, либо увеличение энтропии. На первом этапе движущей силой процесса является возрастание  энтропии воды за счет высвобождения  молекул, участвовавших ранее в  образовании водородных связей с  белковой молекулой, т. к. при формировании спирали образуются новые водородные связи внутри молекулы белка. Основной движущей силой второй и третьей  стадий является возрастание энтропии воды за счет высвобождения молекул, которые ранее были структурированы гидрофобными участками на поверхности белковой молекулы. При формировании гидрофобного ядра, эти участки экстрагируются из водного окружения. Гидрофобный эффект берет на себя, грубо говоря, три четверти работы по созданию белковой глобулы. Но он сам по себе не может создать нативный твердый белок. Он создает лишь расплавленную белковую глобулу, о которой речь впереди. Отвердевает белок, как и все органические жидкости, под действием Ван-дер-Ваальсовых сил, а также водородных и ионных связей - взаимодействий более специфичных и более чувствительных к деталям атомной структуры, чем простая водобоязнь. Но это - окончательная огранка, а большая часть работы, вся черновая работа падает на гидрофобный эффект.

Более подробно рассмотрим третью стадию формирования пространственной структуры. Молекула приобретает пространственную структуру, близкую к структуре  нативного белка. Вместе с тем, она еще не обладает присущей данному белку функциональной активностью. Это состояние, получившее название «расплавленная глобула», отличается от нативного меньшей степенью упорядоченности структуры.

 Размер спиральных участков (цилиндры) в расплавленной глобуле несколько меньше, неполярные группы, формирующие гидрофобное ядро молекулы, «упакованы» недостаточно плотно. В глобуле возникают пoры, куда вода проникает, не разваливая расплавленную глобулу. Отсутствие ряда специфических взаимодействий приводит к изменению ориентации подвижных петель; в целом молекула более лабильна и склонна к «слипанию» с другими такими же молекулами с образованием агрегатов. Таким образом, неспецифическая агрегация может уменьшать число молекул белка, находящихся на правильном пути сворачивания, то есть снижать эффективность этого процесса. Как показали модельные эксперименты, проведенные in vitro, образование «расплавленной глобулы» происходит значительно быстрее, чем ее переход в нативную структуру. Эта реакция, связанная с перебором разных конформаций, является, таким образом, самой медленной стадией процесса сворачивания (от секунд до десятков минут).