Культуры клеток высших растений

Процессу образования  каллуса предшествует дедифференцировка  тканей экспланта. При дедифференцировке  ткани теряют структуру, характерную  для их специфических функций в растении, и возвращаются к состоянию делящихся клеток. Если эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа, то имеет в своем составе эпидермальные клетки, клетки камбия, сосудистой системы, сердцевинной и первичной коровой паренхимы. Преимущественно пролиферируют клетки камбия, коры, сердцевинной паренхимы.

Различное тканевое происхождение  каллусных клеток является одной  из причин гетерогенности каллусной  ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации. В качестве примера можно привести процессы, происходящие при дедифференцировке апикальной меристемы стебля. После помещения на питательную среду меристемы стебля томатов отмечено прекращение митоза, клетки увеличиваются в размерах, теряют характерную для меристематической ткани форму, изменяется структура ядра и цитоплазмы. В готовящейся к делению клетке возрастает синтез всех форм РНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клетки при дедифференцировке.

Активаторами матричной  активности ДНК хроматина или  активности РНК–полимеразы являются фитогормоны. Рецепторные для фитогормонов белки, локализованные в мембранах, по-видимому, оказывают влияние в присутствии фитогормонов на структуру и функцию мембран. Возможно, это обуславливает действие фитогормонов на генную активность.

Одним из важнейших гормонов, применяемых при культивировании in vitro является ауксин, который активирует деление и растяжение клеток. Проникая в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и работу ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин индуцирует работу Н⁺-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок размягчается, что является необходимым условием для роста и растяжения клеток. Включенная Н⁺-помпа усиливает поглотительную активность тканей, обогащенных ауксином. Предполагается, что поступление ауксина в клетку способствует усиле-нию секреции кислых гидролаз и полисахаридов, необходимых для дальнейшего роста клеточных стенок. Под влиянием ауксина уменьшается продолжительность различных периодов митотического цикла. Так, предполагается, что уменьшается продолжительность периода удвоения числа клеток, продолжительность S - периода, G₁ - периода. Все это приводит к значительному ускорению темпов размножения клеток.

Общим моментом в действии ауксинов на деление клеток является также предварительное усиление синтеза и накопление РНК. Стимулирующее  действие ауксинов на синтез РНК может  быть связано с восстановлением  клеток после голодания перед  их вхождением в митотический цикл, но может быть также приурочено к прохождению клетками этапов митотического цикла. Особенно отчетливо необходимость синтеза РНК проявляется при прохождении клетками G1 - периода. Под влиянием ауксина усиливается синтез р-РНК, но имеет место и появление новых информационных РНК, причем на очень ранних этапах действия.

Осуществление клетками подготовки к делению на всех этапах митотического цикла зависит  от синтеза белков. Ауксин вызывает как общую стимуляцию их синтеза, так и появление новых белков. Это позволяет предположить существование в хроматине структурных генов, транскрипция которых специфически индуцируется ауксином. Реализация действия ауксина на хроматин и последующее деление осуществляется вследствие его проникновения в цитоплазму, образования комплекса с цитоплазматическим ауксиновым рецептором и воздействием этого комплекса на транскрипционную активность хроматина. Кроме этого ауксин усиливает окислительную и фосфорилирующую активность митохондрий, в результате чего улучшается энергетическое и субстратное обеспечение процессов синтеза РНК и белков, репликация ДНК, а также осуществление самого митоза. Этот эффект обнаруживается очень рано и, как и синтез РНК, зависит от проникновения ауксина в клетку.

Для возбуждения процессов  подготовки к делению достаточно начального кратковременного действия ауксина. Поэтому процессы, происходящие в клетках под влиянием ауксина, можно разделить на первичные, непосредственно индуцированные ауксином, и вторичные, являющиеся следствием первичного индуцирующего действия. Исходя из этого, можно предположить, что в митотическом цикле растительных клеток имеются кратковременные переходы, когда необходимо присутствие ауксина в клетках, и более продолжительные периоды, когда присутствие ауксинов в клетке не является необходимым.

Морфофизиологическая  характеристика каллусных тканей

Выделяют два типа культивируемых растительных клеток: нормальные и опухолевые.

Опухолевые клетки морфологически мало отличаются от каллусных. Физиологическим  различием является гормононезависимость опухолевых клеток. Благодаря этому свойству опухолевые клетки делятся и растут на питательных средах без добавок фитогормонов. Эти клетки также лишены способности дать начало нормально организованным структурам (корни, побеги) в процессе органогенеза. Иногда они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), дальнейшее развитие которых невозможно.

Нормальные клетки в  культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности  твердой питательной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование осуществляют на полужидкой агаризованной среде, среде с добавлением других желирующих полимеров, на дисках из полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупогруженных в жидкую питательную среду. Можно также использовать комочки ваты, пропитанные питательной средой, которые сверху покрываются кусочком фильтровальной бумаги.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:

- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;

- средней плотности,  с хорошо выраженными меристематическими  очагами;

- плотные, с зонами  редуцированного камбия и сосудов.  Как правило, в длительной культуре  на средах, содержащих ауксины,  каллусные ткани теряют пигментацию  и становятся рыхлыми.

В цикле выращивания  каллусной ткани клетки после  ряда делений приступают к росту  растяжением, дифференцируются как  зрелая каллусная ткань и деградируют. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению  и дальнейшему росту, а также  отмирания каллусных клеток, первичный каллус переносят на свежую питательную среду через 28 - 30 дней, то есть проводят пассирование или субкультивирование каллусной ткани.

Неорганизованно растущая каллусная ткань характеризуется  тремя типами клеток: мелкими, средними и крупными. При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы органогенеза, мелкие клетки приступают к делению и формируют меристематические очаги. Деление клеток меристематического очага приводит либо к формированию почек и последующему развитию из них побегов (геммогенез), либо к ризогенезу (рис. 7, 8).

Клетки меристемы с  самых ранних стадий развития отличаются от каллусных высоким содержанием  РНК и белка. При образовании  соматических эмбриоидов каллусная  клетка средних размеров обособляется, ограничивается плотной оболочкой, теряет крупные вакуоли. Она содержит крупное структурированное ядро с ядрышком. Клетка делится митотически, в результате чего возникают 2 клетки проэмбрио. Последующие деления клеток приводят к формированию шаровидного зародыша, а также органа, аналогичного суспензорам в зародышевом мешке семяпочки. Дальнейшее развитие соматического эмбриона через ряд стадий ведет к регенерации целого растения с корнями и побегами (рис. 9, 10 ), так как в этом случае формируется биполярная структура.

Каллусы с высоким  морфогенетическим потенциалом  обычно матовые, компактные, структурированные, имеют зеленые хлорофиллсодержащие  участки, которые представляют собой  зоны морфогенеза. Впоследствии там  формируются побеги или растения-регенеранты. В культуре также встречаются каллусы рыхлые, не имеющие глобулярного характера. Такие каллусы либо совсем не способны к органогенезу, либо формируют только корни. Появление корней свидетельствует о сдвиге гормонального баланса в сторону ауксинов, что препятствует образованию побегов. Эти каллусы могут остаться ризогенными, и регенерировать из них растения не удастся. Неморфогенные каллусы могут быть переведены в суспензионную культуру для получения вторичных метаболитов.

Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации связан с их дедифференциацией, другими словами — утратой специализации. В основе этого процесса, как и при дифференциации клеток в интактном растении, лежит дифференциальная активность генов. Структура и функции клеток определяются активностью генов, и если клетки различаются по своей структуре и функциям, то это обусловлено различиями в экспрессии их генов, то есть специализация обеспечивается «включением» разных генов в разных клетках. Обычно активна небольшая часть (5%) всего пула генов, свойственных данному виду. В этот состав активных генов входят, кроме видоспецифичных и обязательных для поддержания клеточного метаболизма, гены, активные только в данном органе, ткани, клетке, а также гены, активные лишь в определенном возрасте или начавшие работать только под влиянием изменившихся внешних условий.

Возникновение физиологических  и структурных различий между  клетками и тканями растений, связанное  с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться различными путями, создавая ткани разных органов. Как это осуществляется — один из труднейших вопросов клеточной биологии. Между геномами в клетках, которые приобретают разную форму и функцию, по-видимому, нет качественных различий, и клетки эти начинают различаться только вследствие разной экспрессии генов. Вновь возникшая клетка обладает широкими потенциями и может развиваться по любому из многих путей в морфологическом и физиологическом смысле.

Детерминация (определение) пути развития каждой клетки является основой физиологии развития. Вступление на тот или иной путь развития определяется особым набором белков, т. е. каждая специализированная клетка вырабатывает только ей свойственные белки, что является следствием дифференциальной активности генов — экспрессии одной группы генов при одновременной репрессии других. Способность одной-единственной зрелой соматической клетки дать начало целому организму (тотипотентность) показывает, что в процессе нормальной клеточной дифференциации у растений не происходит утраты или необратимой инактивации каких-либо генов.

У растений почти всякая дифференциация обратима при условии, если дифференцированная клетка живая, в протопласте сохранилось ядро и не образовалась вторичная оболочка. Даже такие высокоспециализированные клетки, как микроспоры, с помощью ряда экспериментальных процедур можно заставить пролиферировать и дать начало целому растению. Итак, в определенных условиях многие из зрелых растительных клеток сохраняют способность делиться, а в некоторых случаях даже вступить на новый путь развития. Однако вопрос о том. как это происходит, какие события на молекулярном уровне сопровождают этот процесс, остается открытым.

Таким образом, после  деления перед каждой дочерней клеткой  открывается одна из трех возможностей. Клетка может оставаться эмбриональной  и вновь вступить в клеточный  цикл с последующим митозом либо может оказаться как бы «вне цикла» (G_o), перестав делиться, и наконец, приобретя компетенцию, постепенно детерминироваться и вступить на путь дифференцировки (специализации). Компетенция — способность клетки воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него изменением развития.

Факторы, влияющие на морфогенез in vitro

Индуцирующее воздействие  могут оказывать различные факторы: гормоны, продукты жизнедеятельности  соседних клеток, других тканей, электрофизиологические сигналы и т. д. Детерминация — приобретение клеткой состояния готовности к реализации определенных наследственных свойств.

Детерминация приводит к развитию по определенному пути с одновременным ограничением возможности  развития в других направлениях. Детерминация компетентной клетки может начинаться сразу же после деления в начале роста протоплазмы. Детерминированная определенным образом клетка приобретает узкую специализацию, то есть дифференцируется и превращается в клетку какой-либо ткани. Из гормональных факторов в дифференциации и морфогенезе первостепенная роль отводится ауксинам и цитокининам.

В отношении органогенеза Скугом и Мурасиге была выдвинута  концепция, согласно которой можно  получить образование стеблей, корней или недифференцированный рост каллуса, изменяя относительное содержание ауксинов и цитокининов. В самом простом случае (табак) индукция и образование каллуса наблюдается при сбалансированном отношении ауксинов к цитокининам, стеблевые почки образуются при повышении уровня цитокининов по отношению к ауксинам, корни формируются при высоком содержании ауксинов в среде. В большинстве случаев формирование органов в культуре клеток можно объяснить гормональной теорией регуляции, но для некоторых видов она оказывается несостоятельной. Одни и те же физиологически активные вещества регулируют и деление клеток при недифференцированном росте каллуса, и клеточные деления, связанные с дифференциацией. Если дифференциация включает изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции, тогда должны существовать и другие специфические вещества, определяющие компетентность клетки к обработке экзогенными фитогормонами.