Культуры клеток высших растений

Культуры  клеток высших растений

Сферы применения культур растительных клеток

Культуры клеток высших растений имеют две сферы  применения:

1.Изучение биологии  клетки, существующей вне организма,  обуславливает ведущую роль клеточных  культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения.

2. Культивируемые  клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать  несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1. Получение  биологически активных веществ  растительного происхождения:

• традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);
• синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;
• культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации). В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.

2. Ускоренное  клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3. Получение  безвирусных растений.

4. Эмбриокультура  и оплодотворение in vitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.

5. Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6. Клеточный  мутагенез и селекция. Тканевые  культуры могут производить регенеранты,  фенотипически и генотипически  отличающиеся от исходного материала  в результате сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.

7. Криоконсервация  и другие методы сохранения  генофонда.

8. Иммобилизация  растительных клеток.

9. Соматическая  гибридизация на основе слияния  растительных протопластов.

10.Конструирование  клеток путем введения различных  клеточных оганелл.

11.Генетическая  трансформация на хромосомном  и генном уровнях.

12. Изучение  системы «хозяин – паразит»  с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых).

История метода

Самые ранние работы по изолированию культур принадлежат Блоцишевскому (1876), Брауну и Моррису (1892), Боннэ, Саксу (1893). В этих исследованиях зародыши вычленялись из семени и выращивались в искусственных условиях. Первым исследователем, занявшимся установлением минимального размера экспланта, был Карл Рехингер (1893). Он выращивал тонкие срезы корня свеклы и одуванчика и сегменты стебля тополя на песке с применением водопроводной воды, без стерильных условий. Эти исследования показали, что каллус образуется при толщине среза не менее 1,5 мм. Еще в 19 веке Х. Фёхтинг провел ряд экспериментов, доказывающих тотипотентность клетки. При этом им убедительно показана полярность как органов, так и клеток.

Основы экспериментальной  эмбриологии растений были заложены исследованиями Моссарта (1902), который наблюдал набухание завязей некоторых растений после обработки их спорами Licopodium, нежизнеспособными поллиниями и водными экстрактами пыльцы. В связи с этим было высказано предположение, что пыльцевая трубка не только обеспечивает передвижение спермиев к яйцеклетке, но и переносит в завязь ауксины, стимулирующие ее рост.

Г. Габерланд (1902) научился культивировать отдельные  клетки в течение некоторого времени. Но он выбрал для культивирования  зеленые клетки, изолированные из клеток палисадной паренхимы Lamium purpureum и волосков традесканции вирджинской и медуницы мягкой,  резонно рассудив, что при этом отпадет потребность в источниках углеводов. Однако упустил из виду то, что ассимилирующие зеленые клетки - зрелые и высокодифференцированные, потеряли способность к меристематической деятельности. Исходное предположение автора, что содержащие хлорофилл клетки полностью обеспечивают себя питательными веществами, необходимыми для их жизнедеятельности и роста, не было подтверждено экспериментально. Габерланд также выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения, которая впоследствии была подтверждена экспериментально. Ряд ученых, в том числе и его ученики, последовали его примеру  и получили отрицательные результаты. Некоторые на основании этого усомнились в гипотезе тотипотентности растительных клеток. Исследования Габерландта  с фотосинтезирующими клетками были неудачны, что привело к потере интереса к культивированию тканей и клеток растений. Однако они все же положили начало поиску адекватных питательных смесей и условий, необходимых для поддержания роста органов, тканей и клеток растений.

Толчком к возобновлению  работ послужили исследования Гаррисона, проведенные в 1904 - 1907 гг. Он вырастил нейробласты лягушки в лимфатической жидкости, доказав возможность выращивания in vitroизолированных клеток. Большое влияние на направление дальнейших работ с растительными клетками оказали работы зоологов Карреля и Барроуза (1911), культивировавших ткани и клетки млекопитающих на среде сложного состава, содержащей плазму крови и экстракты эмбриональных тканей.

Французский ученый Мольяр уже в 1921 культивировал сегменты корня и гипокотиля молодых побегов  редьки. Они были способны к росту  в условиях культуры, но при этом не происходило формирования новых тканей.

В 1922 г. один из учеников Рехингера - Коттэ начал  эксперименты с лишенными пигментов  меристематическими тканями - изолированными кончиками корней, и добился успеха. Практически одновременно и независимо от Коттэ Роббинс подобрал состав питательной среды, обеспечивающий в культуре рост апикальной меристемы корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало культивированию изолированных органов растений на питательных средах. Не всегда эти исследования были успешны.  Под  влиянием работ Карреля и Барроуза в 1927 году Прат начал культивировать клетки растений на средах с добавками растительных экстрактов. Результаты его экспериментов были отрицательны, так как он избрал неудачные объекты для исследований.

Начало длительным и удачным исследованиям по культивированию клеток и тканей растений положили работы американского исследователя Ф. Уайта и француза Р. Готре.  Они показали, что изолированные органы и ткани могут расти в культуре неограниченно долгое время, если их пересаживать на свежую питательную среду. Такую же способность наблюдал Ф. Уайт для клеток опухолевого происхождения. Результаты чужих и собственных экспериментов Уайт обобщил в монографии «Культура растительных тканей», которая была переведена на русский язык и издана в СССР в 1949 году. В ней он выделяет несколько периодов в истории развития метода культуры клеток, тканей и органов растений:

1. 1834 -1900 гг. - создание и разработка клеточной теории.
2. 1900 – 1922 гг. - сформулирована идея культуры тканей.
3. 1922 – 34 гг. - безуспешные поиски методов, обеспечивающих длительное культивирование тканей.
4. 1934 - 39 гг. - детальная разработка техники культуры растительных тканей.

Период 1940 - 1960 гг. значительно расширил список видов, выращиваемых in vitro. В монографию Готре, вышедшую в 1959 г., включено уже 142 вида. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение микро- и макроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности тканей, определено влияние витаминов и стимуляторов роста. Проводились работы по выявлению значения различных натуральных экстрактов (из  эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений) для поддержания неорганизованного клеточного роста, а также для стимуляции органогенеза. Показано значение кинетина для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого морфогенеза. Изучением этих вопросов занимались такие ученые, как Р. Хеллер, И. Нич, Ф. Скуг, Ф. Стевард, Р. Г. Бутенко. В это же время разработаны методы получения и выращивания клеточных суспензий, а также культивирования отдельной клетки, деление которой индуцируется с помощью ткани-няньки.

В 1960 - 1975 гг. положено начало методу получения изолированных  протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлолитических ферментов. Основоположник этого метода - Э. Коккинг. Такебе с сотрудниками были определены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют клеточные стенки, делятся и дают начало клеточным линиям, способным к морфогенезу. Были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, бактерий. В лабораториях Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глебы проводились исследования поведения ядерного и цитоплазматического геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и потомстве соматических гибридов растений - регенерантов. В этот же период были разработаны методы получения безвирусных растений из меристематических тканей. Начались эксперименты по созданию установок для глубинного культивирования клеток.

Начиная с 1976 г., разработывались методы электрослияния протопластов и селекции гибридных  клеток, культивирования гаплоидных клеток и получения новых форм и сортов сельскохозяйственных растений. Удалось создать системы иммобилизованных клеток для получения различных химических соединений и их биотрансформации. Ведутся работы по переносу генов в растительные клетки и получению трансгенных растений.

Культивирование соматических клеток - характеристика, введенеие в культуру, пассирование

В основе культивирования  растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.

Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать  дифференциацию недетерминированных  клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной  дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поранения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа.

Образование каллуса  не всегда связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть и в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза из-за нарушения гормонального баланса. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей различных органов высших растений - корней, листьев, стеблей, пыльников, зародышей (эксплан-ты) помещают на искусственную среду, содержащую ауксины, в пробирки, колбы, чашки Петри (in vitro).

В качестве ауксинов используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), a-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-масляную кислоту (ИМК), индолилуксусную кислоту (ИУК) в концентрации 0,5 - 10 мг / л, в зависимости от вида экспланта.