Клітини с ульфатновідновлюючих бактерій

Лише два організми  – Geobacter matallireducens і Shewanella ( відомий перед тим як Alteromonas ) putrefaciens – використовують U(VI) як кінцевий акцептор електронів. Обидва види мікроорганізмів є аеробними Fe(III) – відновлювальними мікроорганізмами.

Крім того, U(VI) може відновлюватись у середовищі, в якому відсутні Fe(III) – відновлювальні мікроорганізми. Наприклад, утворення мінералів  сульфіду та U(IV) у грунтових водах  підтвердили, що в деяких випадках U(VI) відновлюється в середовищі, у  якому відновлення сульфату є  переважаючим термінальним електрон-акцептуючим  процесом. Дослідження ролі Fe(III) –  відновлювальних мікроорганізмім  у глибоких шарах Атлантичного узбережжя  показало, що вони відсутні у деяких сульфідогенних середовищах.

Неферментативне відновлення U(VI) сульфідом пояснює відновлення U(VI) у сульфідогенних середовищах. Встановлено, що сульфід є слабких відновником U(VI). Альтернативним до цього є те, що мікроорганізми, які живуть у  сульфідогенному середовищі, ферментативно  відновлюють U(VI). U(VI) відновлюють сульфатвідновлювальні бактерії Desulfovibrio desulfuricans. Крім неферментативного відновлення U(VI) сульфідом, можливим є також і пряме ферментативне відновлення U(VI) до U(IV).

Можливість ферментативного  відновлення U(VI) D.desulfuricans  підтверджена експериментально. Показано, що клітинні екстракти D.desulfuricans можуть відновлювати U(VI). Проте фізіологічна роль відновлення урану у клітинних екстрактах метаболізму клітин вивчена недостатньо.

Сульфат наявний у багатьох водних екосистемах, в яких відновлюється U(VI). Тому важливим є дослідження  впливу сульфату на відновлення U(VI). Додавання  цистеїну до води призводило до зростання  рівня відновлення сульфату D.desulfuricans, але при цьому не спостерігалося відновлення U(VI). Тому вивчення відновлення U(VI) за наявності сульфату проводиться з використанням бікарбонатного буферу з додаванням цистеїну. Сульфат суттєво не впливає на відновлення U(VI). Останній, у свою чергу, також не здійснював позитивного впливу на процес відновлення сульфату; вони обидва відновлювались одночасно.

Встановлено, що відновлення U(VI) під час відновлення сульфатів D.desulfuricans є результатом нефермантативного відновлення U(VI) сульфідом, утвореним у результаті сульфатредукції.

Осадження урану з вод  відбувається у результаті його відновлення  до U(VI) мікроорганізмами та є потенційним  механізмом для трансформації урану  в забруднених водах і має  переваги над іншими методами трансформації  урану. Використання D.desulfuricans для відновлення U(VI) може бути більш практичним порівняно  з Fe(III)- відновлювальними мікроорганізмами. Наприклад, біореактор для трансформації  урану з розчинів може містити  бактерії D.desulfuricans, якщо також міститиме низькі концентрації сульфату. Тоді відновлення сульфатів буде забезпечувати енергією для підтримання росту U(VI)-відновлювальних мікроорганізмів. U(VI) стабільний за наявності сульфату. Тому для трансформації урану необхідною є лімітація росту Fe(III)-відновників в біореакторах, оскільки розчинні форми Fe(III) можуть окиснювати U(IV) до U(VI) і Fe(III) оксиди можуть адсорбувати U(VI), утворюючи великі об’єми уранвмісних твердих відходів. Загалом для трансформації U(VI) із забруднених вод необхідно враховувати розповсюдження у них Fe(III)-відновлювальних мікроорганізмів і D.desulfuricans.

Показано, що D.desulfuricans можуть відновлювати U(VI). Це підтверджує те, що при додаванні Fe(III)-відновників  сульфат відновлювальні бактерії можуть відповідати за відновне осадження  урану в навколишньому середовищі.

Ферментативні механізми  дисиміляційної металредукції анаеробними  мікроорганізмами досліджені недостатньо. У літературі є мало відомостей про  виділення й очищення бактеріальних  ферментів, субстратом для таких  слугують метали. Встановлено, що за детоксикацію навколишнього середовища від іонів  ртуті відповідає меркурійредуктаза; описана також Cr(VI)-редуктаза, фізіологічна роль якої ще не до кінця з’ясована, і Fe(III)-редуктаза, яка відновлює хелатовані Fe(III) форми при асиміляції заліза. Однак наявність і функції усіх цих металредуктаз встановлені лише при аеробному метаболізмі. Невідомо, чи вони наявні та функціональні в анаеробних мікроорганізмів. Подальші дослідження дали підстави припустити, що цитохром C₃ є U(VI)-редуктазою у Desulfovibrio vulgaris.

Анаеробні процеси використовуються для очищення стоків уже більше 100 років. Перевагами використання анаеробних процесів є мала потреба у поживних речовинах внаслідок нагромадження  анаеробами невеликої біомаси; зниження витрат електроенергії та, на відміну  від аеробних систем може бути вищим, ніж для аеробних систем. Основними  недоліками застосування очисних систем на основі анаеробних мікроорганізмів  є низька швидкість їх росту і  невелика біомаса.

Для ремедіації застосовують біореактори, в яких відбуваються осадження  іонів металів сульфат відновлювальними бактеріями. При цьому можна використати  два підходи :

1. біологічна і хімічна система процесу працюють незалежно, щоб захистити сульфат відновлювальні бактерії від високої кислотності і підвищених концентрацій важких металів;
2. спочатку використовують сульфат відновлювальні бактерії для відновлення сульфату в сульфіт (1 стадія), що підвищує вилуговування і сприяє осадженню важких металів у стоках. Потім (2 стадія) залишок сульфіду окислюється в спеціальному реакторі з утворенням елементарної сірки, яка може бути використана в хімічній промисловості, наприклад, для виготовлення сульфатної кислоти.

У процесі дисиміляційної сульфат редукції сульфат-іон діє  як окиснюючий агент для дисиміляції  органічної речовини, подібно до кисню  при аеробному диханні. Найбільша  кількість відновленого сульфуру асимілюється мікроорганізмами, але, в основному, він звільняється в навколишнє середовище у вигляді сульфіт-іону, звичайно гідролізованого до гідрогену сульфіду, який є найбільш відновленою сполукою сірки. Загалом процес сульфатредукції  можна представити так :

SO₄+8[H]⁺ àH₂S+2H₂O+2OH^-

Сульфатвідновлювальні бактерії можуть використовувати Cr(VI), U(VI), Tc(VI), Pd(II) та інші метали як акцептори електронів, переводячи їх при цьому у менш токсичні малорозчинні форми. Утворений  у процесі сульфатного дихання  гідроген сульфід осаджує багато металів (наприклад, Cu(II), Cd(II), Ni(II), Pl(II), Zn(II)) у нерозчинні сульфіди або є  сильним відновлювальним агентом, який сприяє редукції металів до відновлених  форм.

Утворення сульфідів металів  – основний механізм, за допомогою  якого сульфат відновлювальні бактерії видаляють важкі метали з розчину. Крім цього, показана можливість сульфат  відновлювальних бактерій до екстра целюлярного зв’язування іонів  міді та їхньої акумуляції біоплівками.

Недоліком біореакторних  установок в умовах in situ ремедіаційних  систем є токсичність іонів металів  для сульфат відновлювальних  бактерій. Тому для ефективного керування  бактерійними процесами в ex situ інженерних споруд виділення чистих культур  мікроорганізмів, які стійкі до високих  концентрацій іонів металів.

Альтернативним до активної ре медіації підходом є пасивне очищення забруднених вод із використанням  субстратів перезволожених біогеоценозів, які в сучасній літературі називаються  ветландами. Тобто, ветланди – це біогеоценози, які формуються на межі води і суші, в природі вони виконують функцію  водних фільтрів. Природні ветланди займають низовини рельєфу, місця виходу на поверхню грунтових вод.

Зазвичай ветланди характеризуються низьким вмістом кисню, змінним  значенням pH, негативним значенням  окисно-відновного потенціалу, що сприяє розвиткові сульфат відновлювальних  бактерій. У ролі очисних споруд для видалення біогенних елементів  і металів часто використовуються штучні ветланди. Розрізняють три  типи штучних ветландів:

1. стічні води очищуються в анаеробних умовах при проходженні через гравій;
2. горизонтальний потік стічних вод надходить у ветланди, де міститься органічний субстрат для стимулювання росту ендогенної мікрофлори;
3. вертикальний потік стічних вод надходить у ветланди, збагачені органічним субстратом. При вертикальній подачі стоків забезпечується послідовна участь аеробних і анаеробних мікроорганізмів у процесі очищення.

Активність сульфатвідновлювальних бактерій в осадах водних екосистем  важлива не лише міграція в них  металів. Сульфатредукція має також  місце при анаеробному розкладі органічних речовин за наявності  сульфату, і видалення металів  сульфат відновлювальними бактеріямиє  ефективним при знешкодженні стоків, які містять органічну речовину разом із сульфатоми. Показано, що у  процесі мікробної сульфат редукції в шахтних водах знижується концентрація сульфатів, у них підвищується pH і, таким чином, створюються сприятливі умови для осадження металів  у формі сульфіду.

Розроблений інтегрований процес із застосуванням автотрофного вислуговування металів сіркоокиснювальними бактеріями з подальшим осадженням металів  у формі сульфідів для видалення  металів-полютантів із грунту.

Вибір типу ветландів залежить від складу води, яка підлягає очищенню. В наш час у світі функціонує більше 1000 штучних і природних  ветландів. Такий підхід до біоремедіації  найбільш популярний у США, де тільки Аппалачах зроблено сотні ветландів  функціонують у Колорадо для очищення кислих шахтних вод від важких металів, а також у Нью Мехіко та Міссурі на підприємствах із видобутку  уранових руд і свинцю. Більше ста подібних споруд до 2000 року діяли в Данії, 71 – у Швеції та Норвегії, 67 – у Канаді, 28 – у Чехії і 30 – у СНД.

Існує перспектива використання сульфат відновлювальних бактерій, стихій до низьких температур, в  умовах бореального клімату. Здатність  мікроорганізмів до росту, використана  для очищення навколишнього середовища, знижується в період з осені до весни через низьку температур. Використання для ре медіації психротолерантних  мікроорганізмів може нівелювати дану перешкоду, оскільки вони здатні не просто виживати при низьких температурах, але й активно рости. Більше того, використання психрофільних і психротоперантних  бактерій для ре медіації є цінним ще тому, що ферменти, які продукуються цими мікроорганізмами, мають вищу каталітичну активність порівняно  з ферментами мезофільних бактерій.

Вплив тяжких металів, і в тому числі хрома на різноманітні мікроорганізми виявляються в зв’язку з проблемами моніторинга забруднення зовнішнього середовища. Стійкість бактерій до них використовують в якості біологічного індикатора забруднення. Вивчена чутливість великого роду чистих культур грамнегативних і грампозитивних бактерій до сполучення шестивалентного хрома – найбільш токсичних серед сполучень цього металу. Однак чисті культури сульфатредуктуючих бактерій, широко розповсюджених в різних водних екосистемах, осадах, протоках і стоках, практично не аналізували.

Стійкість культур сульфатредуктуючих бактерій до Cr⁶ також представляє зацікавленість у зв’язку з використанням цих бактерій в екологічних очистках стічних вод від тяжких металів.

Робота пресв’ячена вивченню впливу різних концентрацій Cr⁶ (K₂ Cr₂O₇) на особливості сірководню культурами Desulfobacterium sp., штами 63 і Desulfotomoculum nigriticans B – 1492.

У експериментах використовували  чисту культуру Desulfobacterium sp., штами 63 виділену із данних відложень Чоргоно моря і культуру Desulfobacterium nigriticans В – 1492 на середовищі Постгейта В. Експерименти по впливи Cr⁶ проводили в періодичній культурі в пробірках об’ємом 20мл, в трьох повторностях на прісноводному середовищі Віддела. Раніше це середовище не використовував для культивування штамів D.nigriticans, тому попередньо зрівняв ріст штама В – 1492 на цьому середовищі і середовищі Постгейта, традиційно використаний для цього виду. Найбільшу кількість сірководню культура штамма на середовищі Постгейта С з лактаном. Якщо приймати ріст на цьому середовищі за 100% , то кількість новоутвореного сірководню на середовищі Видделя з лактатом і етанолом відповідно становила 50 і 78,5%. Тому в дослідах з D.nigriticans В – 1492 при використанні середовища Видделя в якості органічного субстрату використовували етанол. Кінцева концентрація лактата і етанола в експериментах 1,25 і 1,84 г/н відповідно.

 Шестивалентний хром  вносили у вигляді розчинів  K₂ Cr₂O₇ різної концентрації. Культивовані Desulfobacterium sp., штами 63 проводили при 28⁰С протягом 6 год, D.nigriticans В – 1492 при 60⁰С протягом 3 год.

Вмісткість сірководню визначали методом іодеметричного титрування. Концентрацію Cr⁶⁺ вимірювали в супернатанті проб, всаджених центрифугуванням, методом електротермічної електрофотометрії. Кількість виявленого СО₂ і ацетата в культурах встановлювали методом газової і газоворідинної хромотографії.