Клітини с ульфатновідновлюючих бактерій

новних еквівалентів. У  пурпурових сіркобактерій під час фотосинтезу відбувається циклічне транспортування електронів, унаслідок якого генерується трансмембранний електро-хімічний протонний потенціал. Його енергія йде на зворотне транспортування електронів від донора електронів (відновлених сполук сірки) до НАД+. У зелених сіркобактерій відновні еквіваленти утворюються безпосередньо за участю фотосистеми .

Практичні аспекти  циклу сірки

Кругообіг сірки є безперечно важливим процесом у природі, оскільки без нього

життя на Землі було б  неможливим. Проте окремі його ланки  чи мікроорганізми, що беруть участь у них, можуть мати і негативне значення безпосередньо для людини.

Отже, кругообіг сірки  – це складний комплексний процес, у якому бере участь

багато різноманітних організмів. Ключову роль у ньому відіграють мікроорганізми.

Цикл сірки складається  з багатьох ланок, які, відповідно, можуть охоплювати кілька різних процесів. Усі ланки циклу сірки абсолютно необхідні для кругообігу сірки загалом і для існування життя на Землі. Незбалансованість процесів кругообігу сірки може мати важкі негативні наслідки для природи та людини.

Вивчена стійкість чистих культур Desulfotomaculum nigriticans B-1492 і Desulfobacterium sp., штам 63 до різних концентрацій Cr⁶⁺ ( K₂Cr₂O₇). Мезофільний  штам 63, виділений із даних відстійників Чорного моря, представлений рухомими паличками розміром 2,2 – 4,4 х 0,6 – 0,9 мкм, використовують в якості донорів електронів H₂,форміат, лактат, фумарат,малат, етанол,піруват ,здійснюючи їх повне окиснення до CO₂. Культура не росте на ацетаті, вищих жирних кислотах і на ароматичних сполуках, цурках, амінокислотах і спиртах, що відрізняються від етанола. Штам 63 відрізняється від відомих видів роду Desulfobacterium також оптимальною для росту температурою і вміщенням NaCl в середовищі. Мінімальна інгібуюча концентрація хрому для штама В-1492 мг Cr⁶⁺/л (1,4 мМ), для штама 63 що росте на середовищі з етанолом – 35 мг Cr⁶⁺/л(0,7 мМ). Зафіксовані при рості обох штамів виділення Cr⁶⁺ із розчину доходило максимальної величини (93,4%), коли штам 63 ріс на середовищі з етанолом.

 За участю бактерій  відбувається осадження і міграція  важких металів у водоймах  та їх залучення в глобальні  біогеохімічні цикли. Виділяють  такі види взаємодії мікроорганізмів  з металами мобілізацію, іммобілізацію,  акумуляцію й утворення летких  сполук. При мобілізації відбувається  перетворення нерозчинних форм  металів у розчинні, що призводить  до підвищення їх біодоступності  й потенційної токсичності. Утворення  халатних комплексів при виділенні  бактеріями органічних кислот, які  зв’язують метали, сприяє збільшенню їх розчинності на чотири порядки. При іммобілізації відбувається осадження сполук металів, наприклад, кадмію і свинцю при взаємодії з пероксидом водню, СО₂, янтарною кислотою і H₂S, що утворюється при сульфат редукції. Акумуляція – це фізико-хімічний процес поглинання і відкладання металу на поверхні або в середині бактерій у більш високих концентраціях. Для кількісного вираження акумуляції використовують коефіцієнт відношення концентрації речовини в організмі до його концентрації в навколишньому середовищі. Ефективність нагромадження важких металів мікроорганізмами залежить від виду і фізіологічного стану клітини, вмісту металу в середовищі та фізико-хімічної характеристики середовища. Для мікробних клітин характерне нагромадження металів до певного рівня, після якого подальше збільшення їхньої концентрації в середовищі не призводить до більшого поглинання. Час піку поглинання металів бактеріями може коливатися вівд кількох секунд до однієї години після контакту з токсикантом, проте найчастіше достатньо п’яти хвилин. Мертві клітини краще акумулюють метали, ніж живі, за рахунок пошкодження клітинної стінки. Нагромадження токсикантів усередині клітини залежить від функціонування транспортних систем, сполучення з капсулою, структури клітинної стінки, білків клітинної мембрани і цитоплазми, а також від утворення нерозчинних продуктів, наприклад PbHPO₄, Pb(OH)₂, CdHPO₄, Au⁰. Pseudomonas cepaciae акумулює 77 і 53 мг/г сухої біомаси кадмію і плюмбуму, а представники бактерій групи кишкової палички – до 90 мг/г кадмію. Рекомбінантні клітини Escherichia coli можуть адсорбувати до 32 ммоль/г кадмію за рахунок білка С. Клітини Azotobacter sp., і Micrococcus luteus нагромаджують до 300 мг/г кадмію і 490 мг/г плюмбуму. За низьких концентрацій ртуті бактерії роду Vibrio акумулюють значно більше ²³³Hg, ніж представники роду Pseudomonas.

Нагромадження важких металів  у бактеріальні клітини може здійснюватися  системами транспорту іонів (CA²⁺, Na⁺,K⁺ та ін.), що необхідні для нормальної життєдіяльності клітини. Цинк, нікель, кобальт, стронцій, купрум, плюмбум, кадмій та уран переважно транспортуються у клітину, але при цьому частина іонів зв’язується з її поверхнею. Активне надходження цих металів, як правило, здійснюється системою транспорту Mg²⁺, значно рідше – Mn²⁺ і Ca²⁺ за рахунок стереохімічної аналогії. У результаті адаптації мікробних клітин до важких металів збільшується акумуляція останніх в 1,2 – 2,2 разу. Вважають, що бактерії, які населяють екологічні ніші з підвищенним вмістом токсиканта, поглинають його у більших концентраціях, ніж виділені із зон з низькою концентрацією металу.

Утворення летких сполук за рахунок життєдіяльності бактерій, зокрема монометилртуті і диметилртуті, диметилселену, триметиларсену, триметилплюмбуму, монометилкадмію, відбувається за рахунок  транспорту метальної групи за участю S – аденозилметіонінової системи, що сприяє детоксикації середовища і  є важливим природним джерелом важких металів, наприклад, в атмосфері  полярних районів. Pseudomonas putida PpY101/pSR134 за 24 год. Експозиції видаляє 92 – 98% ртуті із розчину, що містить 40 мг/л HgCl₂.

Виділяють три групи значень  концентрації важких металів, що діють  на мікробні клітини. Невисокі концентрації стимулюють розвиток бактерій у зв’язку з проявом ефекту Арндт – Шульца. Порушення бар’єрної функції мембрани сприяє надходженню поживних речовин у клітину і посиленню метаболізму. Плюмбум у концентрації до 0,5 мМ може підвищувати інтенсивність росту грунтових бактерій. Надлишок міді призводить до пригнічення метаболізму клітини. Як токсичні концентрації ртуті, кадмію і плюмбуму в літературі наводяться такі значення : для E.coli – 3 мкг/мл HgCl₂, доданої до поживного середовища, а для Pseudomonas sp. I E.coli – 7,4 мкг/мл CdCl₂; для Pseudomonas sp. – 0,1 мкг/мл Pb(NO₃)₂. Наведені величини є умовними, для лабораторних досліджень характерний відрив від природних умов, оскільки немає можливості для адсорбції і хелатування металів, а також у зв’язку з роботою з чистими культурами або клітинним екстрактом. Додавання сублетальних концентрацій важких металів, наприклад, кадмію, у поживне середовище при довготривалому зберіганні бактерій сприяє підтримання певного рівня стійкості до цього токсиканта.

Ступінь впливу важких металів  на бактерії визначається фізико-хімічними  факторами середовища, наприклад, значенням pH, характеристикою солей токсиканта, метаболізмом бактерій. Недисоційовані солі токсичних металів, що входять  до складу органічних або неорганічних комплексів, менш токсичні, ніж вільні іони в тих самих молярних концентраціях. Негативному впливові сприяє також  наявність конкуруючих катіонів або аніонів незалежно від  їхньої токсичності.

Виділяють три механізми  токсичної дії важливих металів  на біологічні системи: 1)блокування таких  функціональних груп макромолекул, як ферменти і транспорті системи; 2)витіснення і/або заміщення необхідних іонів, наприклад, у метало ферментах; 3)модифікація  активної конформації біомолекул.

Іони металів утворюють  комплекси з гідроксильними, карбоксильними, фосфатними і аміногрупами, а також  ковалентні зв’язки з сульфгідрильними групами, за рахунок чого вони з’єднуються  з білками, нуклеотидами, коферментами, фосфоліпідами, порфіринами й іншими важливими метаболізмами. Токсичні метали порушують транспорті функції, викликають мутагенну дію за рахунок  індукції  генних мутацій і аберацій хромосом, а також призводять до інгібування реплікації ДНК, синтезу  РНК, білка, рибофлавіну, вітаміну В₁₂, пригнічення дихання, порушення функції цитоплазми, процесів фотосинтезу і азотфіксації.

Найбільш токсичним для  мікроорганізмів є іони Hg²⁺ I As²⁺. Вони змінюють поверхневий заряд і електрофізіологічні властивості цитоплазматичної мембрани та цитоплазми, інгібують фотосинтез і дихання, інактивують ферменти, блокують транспорт аніонів через клітини мембрани. Арсен взаємодіє з сульфгідрильними групами білків. Іони арґентуму порушують функцію цитоплазматичної мембрани. Іони купруму інгібують фотосинтез, руйнують поверхневі шари клітинної стінки, сприяючи, таким чином, виходу аніонів. Вважають, що в основі механізму токсичної дії іонів плюмбуму лежать зміни біохімічних параметрів плазматичної мембрани ( активності АТФ-ази) і порушення їхньої бар’єрної функції з подальшим виходом аніонів. До плюмбуму стійкі гриби і неспорові бактерії, чутливі – бактерії, що асимілюють органічні форми азоту. Іони кадмію порушують процес поділу клітин, їхню ультраструктуру, блокують синтез білків, інгібують азотфіксацію, фотосинтез, міцно зв’язуються з низькомолекулярними білками. Іони хрому дуже токсичні для грам негативних бактерій, які гинуть при концентрації цього металу вище 1 мг/л. Грампозитивні бактерії гинуть при більш високих концентраціях.

У відповідь на вплив важких металів у бактерій в процесі  еволюції виробилися механізми стійкості, більшість із яких кодується їхнім  власним геном. 1)Блокування металу за рахунок запобігання його транспортування  в клітину, наприклад Cu²⁺ або H₂S приводить до зв’язування Cd²⁺ на поверхні клітини у вигляді сульфіду у Klebsiella aerogenes . 2)Активне видалення іонів металу, наприклад Cd²⁺ з клітини за допомогою високо специфічних систем, кодованих генами стійкості. У Alcaligenes eutrophus резистентність до кобальту, цинку і кадмію забезпечується системою антипорту з протонами, який де термінується геном czc-NICBARDS, розташованим у плазмі pMOL30. Видалення Cd²⁺ з клітин S.aureus відбувається також за рахунок антипорту з протонами. Катіонтранслокаційна АТ-ФАЗА , кодована геном ZntA, експортує з клітини E.coli іони Cd²⁺, Pb²⁺ I Zn²⁺. 3)Внутрішньоклітинна ізоляція за допомогою металзв’язуючих протеїнів. Синтез адаптаційних метало протеїнів, багатих на сульфгідрильні групи, індукується, наприклад, Cd²⁺. У складі білків клітин коків, виділених з морського середовища, виявлений низькомолекулярний поліпептид, що зв’язує ртуть. 4) Позаклітинна ізоляція, наприклад Pb²⁺ і Cu²⁺ за допомогою полісахаридів, та Ni²⁺, Cu²⁺ I Co²⁺ - індуцибельних поверхневих білків у бактерій роду Pseudomonas. Капсула у штамів Klebsiella aerogenes забезпечує високу резистентність до Cd²⁺. 5)Ферментативне перетворення металів у менш токсичні форми, наприклад CH₃Hg I Hg²⁺. У Alcaligenes faecalis стійкість до арсену визначається генами arsB i ars C. Третій ген кодує фермент, який перетворює внутрішньоклітинний As(V) у As(III).

Описано п’ять механізмів стійкості до ртутію 1) Зменшення поглинання іонів Hg²⁺, наприклад, у Enterobaster aerogenes, пов’язане з експресією двох плазмід, що кодують білки, які знижують клітинну проникність. 2) Деметилізація органортутних сполук, наприклад у Clostridium cochlearium T2, відбувається за рахунок факторів, кодованих двома плазмідами, з подальшим утворенням нерозчинних сульфідних сполук ртуті при взаємодії з гідроген сульфідом. 3) Ізоляція метил ртуті у Desulfovibrio desulfuricans API відбувається при постійному утворенні сірководню зі сульфату у процесі дисиміляційної сульфатредуції, який реагує з метил ртуттю з утворенням нерозчинного сульфіду метил ртуті. Процес метилування де термінується плазмідами і хромосомами. Для бактерій, що населяють грунти, води, травну систему, спостерігається ізоляція або випаровування ртуті. Наприклад, у Desulfovibrio desulfuricans LS цей процес є двостадійним за рахунок переносу метальних груп від метилтетрагідрофолату до метилкобаламіну, а потім – до Hg²⁺. 5) Ферментативне відновлення Hg²⁺ до Hg⁰ відбувається у клітинах грам негативних і грам позитивних бактерій, виділених із різних джерел.

Таким чином, за наявності  в середовищі важких металів спостерігається  відповідь бактерій на екосистемному, популяційно-біоценозному, клітинному та молекулярному рівнях.

Із забрудненого металами середовища виділені споро утворюючі  сульфат відновлювальні бактерії Desulfotomaculum reducens sp. Nov. MI-1, які, окрім різних сполук сірки, можуть використовувати Cr(VI), Mn(IV), Fe(III) i U(VI) як акцептори електронів. Клітини D.reducens рухомі, паличкоподібної форми, розмірами 0,8 – 1, 0х5 – 10 мкм. Оптимальна температура для росту – 37⁰С, pH – 7,0 – 7,2, концентрація NaCl 0 – 2 %. Бактерії штаму MI – 1 як донори електронів використовують широкий спектр органічних сполук, у тому числі жирні кислоти з коротким ланцюгом (C₃-C₅; пропінат, бутират і валеріат); спирти (C₁-C₄; метанол, етанол, н-пропанол і н-бутанол); лактат, піруват і глюкозу. Ацетат, фумарат і H₂/CO₂ (80:20) не утилізують. Наведені субстрати є характерними і для інших споро утворюючих сульфат відновлювальних бактерій. Крім того, 28 мМ сульфат, 10 мМ тіосульфат, 10 мМ дитіоніт і елементна сірка (-1%) спугують акцепторами електронів.

Характерною ознакою штаму MI-1 є те, що він використовує метали як акцептори електронів для росту  за відсутності сульфату. З бутираном  як джерелом карбону штам MI-1 може рости  з Mn(IV), Fe(III), U(VI) або Cr(VI) за відсутності  сульфату. Інші донори електронів, такі як лактат або валеріат, також підтримують ріст з цими акцепторами електронів.

У всіх випадках джерела  карбону окислювалися неповністю, до ацетату; за відсутності акцептора  електронів ріст бактерій був відсутній. Ріст штаму MI-1 спостерігався протягом 20 год з цими металами, як і зі сульфатом. Оскільки Fe(III), Mn(IV), U(VI) I Cr(VI) високотоксичні для мікроорганізмів, для підтримання росту бактерій з Cr(VI) як акцептора електроныв його вносили у середовища в малих кылькостях.

Після кожного додавання Cr(VI) до культури він повністю вичерпувався і нагромаджувалася біомаса, вказуючи на те, що ріст бактерій залежить від  наявності у середовищі хрому. За відсутності у середовищі сульфатів Cr(VI) відновлювався до Cr(III), про що можна зробити висновок на основі появи сірого осаду Cr(OH)₃, який утворюється на дні пробірки. Концентрація Cr(VI) більше 200 мкМ інгібувала ріст цих бактерій.

Механізм відновлення Cr(VI) i Mn(IV) за участю штаму D.reducens MI-1 невідомий. Важливо зазначити, що Fe(II) у концентрації близько 27 мкМ у середовищі діє як відновник завдяки ре циклюванню феруму в культурі. Cr(VI) I Mn(IV) можуть вівдновлюватися непрямо через Fe(II) штамом MI-1. У контрольних експериментах без клітин початкова швидкість відновлення Fe(III), Mn(IV), U(VI) i Cr(VI) значно нижча, ніж за наявності клітин. Ці результати вказують на те, що відновлення Cr(VI), U(VI), Mn(IV), як і відновлення Fe(III), здійснюється штамом MI-1.

Яким чином штам D.reducens MI-1 може відновлювати ці метали? Різниця  спектрів карбон моно оксиду цитоплазматичних фракцій показала різні піки поглинання в ділянці 400 – 595 нм. Максимуми поглинання при 520, 483 і 419 нм підтверджують наявність  цитохромів b i c. Тому механізм дисиміляційного  відновлення металів може включити цитохроми, схожі до тих, які виявлені при відновленні Cr(VI) I U(VI) іншими сульфатвідновлювальними бактеріями. Залишається незрозумілим, чи штам D.reducens MI-1 конкуруватиме з іншими метало відновлювальними організмами за акцептори електронів, чи утилізуватиме ці метали як акцептори електронів, адаптуючись до виживання за несприятливих умов.

Встановлено, що сульфат  відновлювальні бактерії можуть відновлювати метали ферментативно або через  утворення гідрогену сульфіду, і  тому низькі концентрації таких металів, як Cr(VI), Hg(II) i Zn(II), підсилюють ріст і  сульфатвівдновлювальну активність цих  бактерій. Tebo і Obraztsova вперше показали, що сульфатвідновлювальні бактерії можуть рости, окиснюючи органічні речовини і відновлюючи Cr(VI) до Cr(III), Mn(IV) до Mn(II), Fe(II) і U(VI) до U(IV), і вперше продемонстрували, що відновлення Cr(VI) підтримує анаеробний ріст багатьох організмів.

Дослідження механізмів, залучених  до відновлення металів, є необхідним для розуміння того, як важкі метали відновлюються клітинами, чи існує  ієрархічна перевага акцептора електронів і як клітини стають толерантними до таких токсичних металів, як Cr(VI).

Мікробне відновлення  розчинного U(VI) до нерозчинного U(IV) відіграє важливу роль у геохімічному циклі урану і може слугувати механізмом для біоремедіації уранвмісних вод. Утворення U(IV) в результаті відновлення U(VI) в анаеробних морських осадах є важливим глобальним процесом. Відновлення U(VI) приводить до утворення значних економічно важливих покладів урану. Біореактори, що містять U(VI) – відновлювальні мікроорганізми, можуть мобілізувати розчинений уран із води.