Клітини с ульфатновідновлюючих бактерій

Типовий (і єдиний) вид  – Desulfurella acetivorans.

Рід Desulfuromonas.

Клітини від паличковидних до овальних, інколи зігнуті, 0,4 – 0,8 х 1 – 4 мкм. Грамнегативні. Одинокі латеральні джгутики обертаються подібно пропелерам. Строгі анаероби. Відновлюють сірку до H₂S. Сульфат та інші оксоаніони сірки ніколи не відновлюють. Донорами електронів служать ацетат, пропіонат і етанол. Органічні субстрати окислюють повністю, до СО₂. Колонії при рості на агаризованих середовищах розові внаслідок високого вмісту цитохромів або інших пігментів. Для росту потребують біотин. Оптимум pH 6,8 – 7,5. Екстремально термофільні види невідомі. Оптимум Т⁰С=30. Місце перебування – без кисневі морські осади.

Типовий (і єдиний) вид  – Desulfuromonas acetoxidans.

Сірка як один з біогенних  елементів є в складі всіх живиж  організмів. Вона міститься в амінокислотах (0,8 – 2,4%), вітамінах, коферментах, а  також рослинних ефірних оліях. Тому кругообіг сірки має важливе значення для підтримання життя на Землі. У великих кількостях її сполуки наявні в земній корі, кам’яному вугіллі, сланцях, нафті, природний газ.

Також сірка є елементом  зі змінною валентністю, тому вона може вступати у різноманітні хімічні  та біохімічні окисно-відновні реакції. Переважна більшість таких реакцій  у природі відбувається за участю живих організмів. Значення цих реакцій  для різних організмів різне –  для одних вони є джерелом енергії, інші використовують продукти цих реакцій  у процесах катаболізму, для ще інших  субстрати цих реакцій є донорами електронів.

Циклічні перетворення сполук сірки називають кругообігом  сірки. Кругообіг сірки складається  з окислювальних і відновлювальних  стадій, а також з процесів, що відбуваються без зміни ступеня  окиснення сірки. Загалом у процесах кругообігу сірки ступінь її окиснення  змінюється від -2 до +6. Більшість процесів кругообігу сірки забезпечують мікроорганізми.

У місцях кроишніх сіркодобувних  кар’єрів часто виникає складна  екологічна ситуація, пов’язана з  порушенням процесів кругообігу сірки. Внаслідок окиснення елементарної сірки накопичуються сульфати, що створює сприятливі умови для розвитку сульфат відновлювальних бактерій. Наслідком цього є нагромадження сірководню, що токсичний для всіх живих організмів.

Відновлення сульфатів відбувається у процесах дисиміляції та асиміляційної сульфатредукції. Принциповою відмінністю цих процесів є те, що головна функція дисиміляційної сульфат редукції – забезпечення клітини енергією, а асиміляційна слугує лише для забезпечення клітини органічною сіркою.

Дисиміляційну сульфатредукцію забезпечують сульфат відновлювальні бактерії, які використовують сульфат як кінцевий акцептор електроні і отримують енергію для ромту внаслідок окиснення органічних речовин і молекулярного водню.

Мікроорганізми, що здатні відновлювати сульфати, належать до чотирьох неспоріднених груп. Найбільша з них належить до класу Deltaproteobacteria лінії Proteobacteria домену Bacteria й охоплює роди Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfobaster, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonas та ін.. Друга група представлена родом Desulfotomaculum, що належить лінії Firmicutes. Третя група – це лінія Thermodesulfobacteria з єдиною родиною Thermodesulfobacteriaceae і єдиним родом Thermodesulfobacterium. Четверта група – це рід Archaeoglobus, що належить до родини Archeglobaceae  домену Archaea.

Клітини сульфатвідновлювальних бактерій мають різноманітну форму: сферичну, овальну, паличкоподібну, спіральну або вівброїдну. Їхні розміри становлять від 0,4 до 3,0 мкм. Клітини можуть бути поодинокі, у парах або агрегатах. Трапляються також форми у вигляді однорядних багатоклітинних ниток. Клітини більшості родів грамнегативні, проте окремі представники нитчастих і спороутворювальних форм можуть забарвлюватися за Грамом позитивно. Всі сульфатвідновлювальні бактерії – строгі анаероби. Окрім сульфатів, вони в деяких випадках можуть відновлювати сірку. Усі досліджені види здатні фіксувати молекулярний азот. Місце перебування – без кисневі осади або придонний шар у прісноводних, морських або сильно засолених водоймах.

Для сульфат відновлювальних  археїв характерні кокоподібні клітини  неправильної форми, часто трикутні, діаметром 0,4 – 1,3 мкм, поодинокі чи в парах, можуть бути з джгутиками. За Грамом воно зафарбовують негативно. Утворюють зеленкувато-чорні блискучі колонії діаметром 1-2 мм. Як і сульфат відновлювальні бактерії, вони є строгими анаеробами, що здатні до хемолітотрофного, хемоорганотрофного чи хемоміксотрофного живлення. Окрім сульфатів, можуть відновлювати сірку, проте в цьому разі не простежено росту. Сульфатвідновлювальні археї ростуть при температурі 60-95⁰С, pH 4,5 – 7,5 та солоності середовища (за NaCl) 0,9 – 3,6%, оптимальна температура – близько 83⁰С, pH – близько 6.

Сульфатвідновлювальні бактерії є головним продуцентами сірководню в природі. Експериментально доведено, шо у водах, збагачених сульфатами, інтенсивність сульфат- редукції визначає швидкість розвитку фотосинтезувальних і безбарвних сіркобактерій та є каталізатором кругообігу речовин біотопу загалом. Екологічні дослідження підтверджують значне поширення сульфатвідновлювальних бактерій у водоймах різного типу. В усіх випадках ці мікроорганізми виявляли тільки в анаеробних умовах, причому їхня кількість була найбільшою в поверхневому шарі мулових відкладів. У прісних оліготрофних озерах кількість бактерій не перевищувала 10 клітин в 1 мл, у прісних мезотрофних коливалась від 0,5х10³ до 0,47х10⁶ клітин/мл, у прісних евтрофних – до 3х10⁵ клітин/мл. У мулах солоних евтрофних озер виявлено десятки мільйонів клітин сульфатвідновлювальних бактерій 1 мл.

Активні сульфат відновлювальні бактерії виявлені в широких межах  коливань окисно-відновних умов, при Eh від – 195 до +190 mB. rH₂ 7,6 – 20,8 і pH 4,9 – 7,5. У разі високого окисно-відновного потенціалу ці мікроорганізми знайдені лише в озерах без кисню і з високою концентрацією солей закисного заліза, що й зумовлювало додатне значення Eh.

Сульфатвідновлювальні бактерії здатні до хемоорганогетеротрофного, хемолітогетеротрофного та хемолітоавтотрофного живлення. Ріст у хемолітогетеротрофних та хемолітоавтотрофних умовах відбувається завдяки окисненню молекулярного водню чи інших неорганічних сполук.

Пркладами бактерій, що забезпечують хемолітогетеротрофний метаболізм, є низка штамів Desulfovibrio sp., Desulfotomaculum sp., D. nigrificans.  Ю. Сорокін уперше довів, що бактерії роду Desulfomaculum ростуть хемолітогенетрофно внаслідок окиснення молекулярного водню, використовуючи ацетат і СО₂ в конструктивному обміні. Включення ацетату і СО₂ у D. vulgaris відбувається у незамкненому циклі трикарбонових кислот (ЦТК) через утворення ацилу, що перетворюється в піруват. Піруват і СО₂ далі перетворюються в оксалоацетат.

До хемолітоавтотрофного росту здатні, наприклад, Desulfotomaculum orientis, D. autotroficum, Desulfobacter hydrogenophilus, Desulfococcus niacin, Desulfonema limicola, Desulfotomaculum kuznetzovii, Archaeglobus sp. Вид Desulfobacter hydrogenophilus добре росте в середовищі H₂+СО₂ за наявності сульфату.

Під час хемоорганогетеротрофного росту сульфатовідновлювальні бактерії можуть використовувати як донори вуглецю  та енергії такі сполуки: лактат, піруват, форміат, ацетат, пропіонат, бутират  та інші жирні кислоти, етанол, фруктозу, ацетон, дикарбонові кислоти, амінокислоти, вуглеводні та інші сполуки.

Сульфатвідновлювальні бактерії можна умовно розділити на дві  групи. Група А охоплює ті з  них, які за наявності сульфатів  окислюють органічні речовини до ацетату і СО₂, тобто не повністю. Група B об’єднює види, що окиснюють низки органічних речовин за наявності сульфатів повністю до СО₂.

У бактерій групи А, як звичайно, нема окремих ферментів циклу Кребса. Прикладом таких організмів може бути рід Desulfovibrio.

У процесі гетеротрофного росту органічні сполуки, що їх сульфат  відновлювальні бактерії використовують як донори електронів, одночасно є  джерелом вуглецю для клітинного синтезу. Проте в деяких випадках, крім них, у конструктивному обміні бактерії можуть застосовувати вуглекислий газ. У випадку автотрофного росту вуглекислий газ стає єдиним джерелом вуглецю.

Відновлення сульфату до сульфіду є восьми електронним ступеневим процесом, що відбувається через низку проміжних сполук. Однак сульфат відновлювальні бактерії не виділяють цих сполук у навколишнє середовище. Тільки в двох випадках повідомлено про екскрецію малих кількостей сульфіту та тіосульфату Desulfovibrio desulfuricans. Це не обов’язково засвідчує, що тіосульфат є прямою проміжною сполукою.

Оскільки всі ферментативні  реакції відновлення сульфату відбуваються у цитоплазмі або на внутрішній стороні  плазматичної мембрани, то сульфат  повинен проникнути в клітину. Результати досліджень зі штамами Desulfovibrio, Desulfobulbus propionicus та Desulfococcus multivorans підтвердили ,що поглинання сульфату в сульфат відновлювальних бактерій відбувається завдяки іонному градієнту. У прісноводних видів (Desulfococcus desulforicans, Desulfobilbus propionicus) сульфат транспортується одночасно з протонами. У помірно галофільних видів (Desulfovibrio salexigenes, Desulfococcus multivorans) поглинання сульфатів забезпечене потоком іонів натрію.

Перед відновленням сульфат  активує АТФ – сульфурилаза; продуктом  є аденозинфосфосульфат (АФС). АТФ- сульфурилаза значно  поширена в природі і  знайдена майже у всіх типах організмів. Молекулярні маси різних АТФ-сульфурилаз  варіюють залежно від виду та мають  моно-ди, тетра- або гексамерну структуру. Більшість АТФ-сульфурилаз складається з однакових субодиниць, на відміну від ферменту E. Coli K12, що складається з двох різних субодиниць. АТФ-сульфурилази Desulfovibrio desulfuricans та D. gigas є гомотримерами з приблизними молекулярними масами та 147 кДа. АТФ-сульфурилаза містить кобальт і цинк.

АТФ є електронним акцептором, що перетворюється до сульфіту або  бісульфіту та АМФ під дією АФС-редуктази. Цей фермент також виявлений  у деяких фотолітотрофних пурпурових і зелених бактерій та кількох  тіобацил. У цих бактерій АФС-редуктаза каталізує зворотню реакцію. Усі АФС-редуктази є негемтвини залізо-сірковими флавопротеїнами. В разі очищення АФС-редуктази з D.desulfuricans та D. Vulgaris отримали високоактивний фермент. Очищенний фермент має гетеродимерну структуру (aB) та молекулярну масу 95 кДа. На підставі даних про первинну структуру вважають, що а-субодиниця містить одну молекулу ФАД, а b-субодиниця – два [4Fe-4S]-центри. Ці дві субодиниці перебувають у тісному контакті між собою. АФС-редуктаза здатна приєднувати сульфіт у положенні N(5)ФАД.

Дисиміляційна АФС-редуктаза  також перетворює сульфіт і АМФ  до АФС у процесі аноксигенного  фотосинтезу та денітрифікації у  фототрофних і денітрифікувальних бактерій.

Активність АФС-редуктази, як і іншіх ферментів, залежить від багатьох чинників. Активність прямої та зворотної реакції не залежить від концентрації ферменту. Висока концентрація солей (0,5 – 1,0 М) пригнічує фермент, найвища активність зафіксована за концентрації солей 20 мМ.

На відміну від прямої реакції, кінетика зворотної реакції  цілком підпадає під закон Міхаеліса. Зворотну реакцію інгібує АМФ, у  разі його концентрації 1,8 мМ реакція  повністю припиняється.

Наступним етапом процесу  дисиміляції сульфат редукції є  відновлення сульфіту. Сульфіт (:SO₃^2-) або його протонова форма бісульфіт (траутомерні форми [:SO₂O-H]^- та [H-SO₂O:]^-), що практично однаково поширенні при pH 7,0 (pK_a2=6,99), є пірамідальними молекулами з вільними електронними парами біля сірки і значно реакційноздатніші, ніж сульфат. Припускають, що бісульфіт, а не сульфіт є субстратом у разі відновлення до сульфіду і, як наслідок, сульфітредуктазу називали біосульфітредуктазою. Відновлення сульфіту (+IV) до сульфіду (-II) під дією сульфітредуктази передбачає транспортування шести електронів.

Активні центри дисиміляційної та асиміляційної сульфітредуктаз характеризують двома металокофакторами – редукованими порфірином ізобактеріохлорінового класу – сирогеном та  залізо-сірковим кластером ([FeS]). Їхньою функцією є транспортування електронів до субстрату.

У сульфат відновлювальних  бактерій відповідно до ультрафіолетових видимих спектрів поглинання та інших  молекулярних характеристик розрізняють  чотири головні типи дисиміляційних сульфітредуктаз: зелений білок  десульфовіридин, червонувато-коричневий десульфорубідин і десульфофусцидин та P582. Дисиміляційні сульфітредуктази загалом мають структуру a₂B₂. Однак у дисиміляційній сульфітредуктазі типу десульфовіридину Desulfovibrio vulgaris та D. desulfuricans Essex знайдений третій тип субодиниці (y), що дає змогу припустити про наявність у них гексамерної структури ферменту.

Існує дві гіпотези, які  пояснюють відновлення сульфіту до сульфіду: послідовне відновлення через три двохелектронні кроки з утворенням тритіонату та тіосульфату як проміжних сполук, та пряме шестиелектронне відновлення без їхнього утворення .

В асиміляційному метаболізмі  сірки сульфітредуктаза утворює сульфід для син-

тезу сірковмісної амінокислоти цистеїну. Метіонін та кофактори (наприклад, кофермент А) отримують сірку з цистеїну. Асиміляційні сульфітредуктази (аСіР) з високою ймовірністю відновлюють сульфіт до сульфіду через шестиелектронне відновлення . Сульфітредуктаза, виділена з D. vulgaris, відновлювала сульфіт до сульфіду подібно до аСіР з E. coli. Тому її назвали “асиміляційноподібною сульфітредуктазою” . Фермент детально вивчений. Асиміляційна сульфітредуктаза D. vulgaris експресована в інших видів Desulfovibrio , а аСіР сульфатвідновлювальних бактерій відрізняються від аСіР E. coli та дисиміляційних сульфітредуктаз сульфатвідновлювальних бактерій. Перші складаються лише з одного поліпептиду і не утворюють мультимерних білків; вони мають низькоспінове залізо замість високоспінового і тільки один сирогем та [FeS]-кластер на молекулу . Тан та Кован запропонували механізм шестиелектронного відновлення, каталізованого аСіР, що може також бути робочою гіпотезою для розуміння інших сульфітредуктаз. Атом сірки сульфіту зв’язується з іоном Fe2+ сирогему з незв’язаної сторони. Двохелектронне відновлення готує атом кисню SO-зв’язку для протонування так, що може бути елімінований гідроксил-аніон. Через повторюване відновлення двома електронами і наступне протонування атоми кисню поступово “відбираються” від сірки, внаслідок чого утворюється сульфід .

До асиміляційної сульфатредукції  здатні майже всі рослини і  мікроорганізми.