Клонирование

Неудачи  экспериментов  с  мышами 

      Успешные  опыты  с  амфибиями  заставили  задуматься  учёных  о  клонировании  млекопитающих, в  частности  мышей.   

     Мак Киннелл  в  одной  из  своих  работах  отмечал, что  необходимые  для  этого  методы  уже  существуют  и  непонятно  почему  мышь  до  сих  пор  не  клонирована.  

     Однако  предсказания  Мак  Киннелла  не сбылись, хотя  в  конце 70-х   гг.  опыты  на  мышах  действительно  начались  и  протекали  весьма  драматично. К  тому  времени  весьма  основательно  были  изучены  биология  и  генетика  ранних  этапов  развития  млекопитающих  и  в  частности  мыши  как  модельного  объекта.   

      Работа  методически  оказалась  довольно   трудной, прежде  всего,  потому  что  объём  яйцеклетки  у  млекопитающих  примерно  в  тысячу  раз  меньше, чем  у  амфибий. Однако  эти  трудности  были  успешно  преодолены. Экспериментаторы  научились  успешно  микрохирургическим  путём  удалять пронуклеусы  (одно  из  двух  гаплоидных  ядер  в  яйце  млекопитающих, в  период  после  проникновения  сперматозоида, но   до  слияния  женского  и  мужского  пронуклеусов  в  ядро  зиготы  в  процессе  оплодотворения. Мужское  ядро  формируется  из  ядерного  материала  сперматозоида, женское  из  хромосом  яйцеклетки)  из  зигот  мыши  и  пересаживать  в  них  клеточные  ядра  ранних  эмбрионов. Однако  все  полученные  разным  способом  зародыши  мышей  развивались  лишь  до  стадии  бластулы.    

    В  1977  году  появилось  сенсационное  сообщение  Хоппер  и  Илменсе  о  том, что  они  получили  7  взрослых  самок  мышей, пять  из  которых  имели  только  материнский, а  две  отцовский  геном. Это, якобы, зависело  от  того,  какой  пронуклеус  был  оставлен  в  яйце – женский  или  мужской, он  и  определял  особи  по  типу  гиногенеза  или  андрогенеза  (гиногенез – развитие  яйца  без  участия  сперматозоида, андрогенез – развитие  яйца, имеющие  только  отцовские  хромосомы – мужской  партеногенез).

Их  успех  был  связан, по  описанию  авторов, с  тем, что,  удаляя  один  пронуклеус, они  удваивали  число  хромосом   другого, обрабатывая  яйца  специальным  веществом, затем  выращивали  полученные  диплоидные  гомозиготные  зародыши  in  vitro  до  стадии  бластулы  и  пересаживали  в  матку  самки-реципиента  для  дальнейшего  развития.       

 Казалось, теперь  можно  будет  быстро  получить  млекопитающих  со  100%  гомозиготностью  по  всем  признакам. Это  особенно  важно  для  селекции, так  как  для  получения  сельскохозяйственных  животных, в  частности  крупного  рогатого  скота  с  закреплёнными  особо  ценными  качествами  обычными  приёмами  требуются  десятки  лет  работы.  

       Однако  данные  Хоппер  и  Ильменси  подтвердить  не  удалось, хотя  многие  пытались  это  сделать. Оказалось, что  полученные  любым  способом  диплоидные  андрогенетические  и  гиногенетические  зародыши  мышей  погибают,  а  тех  же  стадиях, что  и  диплоидные  партеногенетические  (развивающиеся  из  неоплодотворённой  яйцеклетки)   эмбрионы.         

 Значительно  усовершенствовав  методы  извлечения  ядер  и  введения  их  в  клетку, Мак Грат   и  Солитер  провели  свою  серию  экспериментов  и  сообщили, что  высокий  выход  живых  мышей  они  получили, когда  в  качестве  доноров  ядер  они  использовали  зиготы, но  если  донорами  были  ранние  эмбрионы, то  реконструированные  яйцеклетки, как  и   прежде, развивались  только  до  стадии  бластулы.     

   Метод  Мак Грата- Солитера  стал  широко  использоваться  разными  экспериментаторами. Так  Манн  и  Ловел-Банж  выделяли  пронуклеусы  яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживал их  в  энуклеированные  зиготы  мышей. В  этих  случаях  эмбрионы  погибали  на  ранних  стадиях.

Если  же, наоборот, пронуклеусы  получали  из  оплодотворённых  яиц  и  пересаживали  в  партеногенетические  и  лишённые  ядра  яйца, то   такие  зародыши  развивались  нормально  до  рождения.       

 Сурами  с  соавторами  установили, что  если  добавить  женские  пронуклеус   из  зиготы  мыши  к  гаплоидному  набору  хромосом  яйцеклетки, то  нормального  развития  не  происходит, добавление  же  мужского  ядра  приводит  к  нормальному  развитию. С    другой  стороны, рекомбинация  женского  и  мужского  пронуклеусов  из  ранних  оплодотворённых  яйцеклеток  мышей  обеспечивает  нормальное  развитие, а  комбинация  2-х  мужских  или  2-х  женских  пронуклеусов  останавливает развитие  эмбриона.    

     Эти  опыты  показали, что  для  нормального  развития  млекопитающих  требуется  два  набора  хромосом – отцовский  и  материнский. Поэтому  ни  у  одного  из  известного  вида  млекопитающих  не  описан  партеногенез. Поэтому  же  работы  Хоппер  и  Ильменсе  не  удалось  повторить.        

 Однако  такие исследование ещё дважды  будоражили научное  сообщество. В  1982  году  пересадили  ядра  клеток  партеногенетических  бластул мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих  реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и  якобы  получены  четыре взрослых самки, но  в свете вышесказанного эти  результаты  маловероятны.         

 Гибель  партеногенетических  (гиногенетических и  андрогенетических)  зародышей  у  млекопитающих  связана  с  различной  активацией  онтогенеза  материнского  и  отцовских  геномов. Механизм, регулирующий  эти  функциональные  различия, был  назван  геномным  импритингом  и  изучался  в  ряде  работ, где  было  показано, что  для  нормального  развития  млекопитающих  требуется  наличие  мужского  генома.     

 Другая  статья  Ильменсе  и  Хоппер  имела  ещё  больший  резонанс. Авторы  сообщили  о  пересадки  ядер  внутренней  клеточной  массы   бластулы  в  энуклеированные  зиготы  мышей  и  получения  трёх  взрослых  особей  (двух  самок  и  одного  самца), генетически  идентичной  донорской  линии  мышей.         

 Введение  ядер-доноров  и  удаление  пронуклеусов  из  зиготы  проводили  за  один  приём, затем  реконструированные  яйцеклетки  культивировали  «in  vitro»   до  стадии  бластулы и  пересаживали  в  матку  самок. Из  16  пересаженных  бластул  три  развились  во  взрослые  особи. В  следующей  работе  эти  же  авторы  использовали  в  качестве  доноров-ядер  клетки  эмбрионов  ещё  более  поздней  стадии (семь  суток)  и  будто  бы  получили  трёх  половозрелых  мышей. Однако  никто  из  работающих  в  том  же  направлении  не  смог  добиться  подобных  результатов, и  достоверность  результатов  Ильменсе  и  Хоппер  вновь  была  поставлена  под  сомнение.   

      Мак Грат  и  Солитер  показали, что  ядра  8-клеточных  зародышей  и  клеток  внутренней  клеточной  массы  бластулы  не  обеспечивают  развития  «in  vitro»  реконструированных  яйцеклеток  даже  до  стадии  морулы, которая  предшествует  стадии  бластулы. Наибольшая  часть  (5%) 4-клеточных  зародышей  даёт  возможность  развиваться  только  до  стадии  морулы. В  тоже  время  19%  реконструированных  яйцеклеток  2-ядерных  клеточных  зародышей, смогли  спокойно  достичь  стадии  морулы  или  бластулы.         

 Эти  и  другие  данные  показывают, что  в  эмбриогенезе  у  мышей  клеточное  ядро  рано  теряет  тотипотентность, что  связано, очевидно, с  очень  ранней  активизацией  генома  зародыша – уже  на  стадиях  двух  клеток. У  других  млекопитающих, в  частности  у  кроликов, овец  и  крупного  рогатого  скота, активизация  первой  группы  генов  в  эмбриогенезе  происходит  позднее, на  8-16  клеточной  стадии.

Возможно,  поэтому  первые  значительные  успехи  в  клонировании  животных  были  достигнуты  на  других  видах  млекопитающих, а  не  на   мышах. 

           Тем  не  менее,  особый  интерес  вызывают  опыты  группы  учёных  из  университета  в  Гонолулу  во  главе  с  Риузо  Янагимачи. Авторам  удалось  усовершенствовать  метод  Уилмута. Они  отказались  от  электрической  стимуляции  слияния  донорской  соматической  клетки  с  яйцеклеткой  и изобрели  такую  микропипетку, с  помощью  которой  можно  было  бы  безболезненно  извлекать ядро  из  соматической  клетки  и  трансплантировать  его  в  обезъядренную  клетку. Кроме  того, авторы  использовали  в  качестве  донорских  относительно  менее  дифференцированные  ядра  клеток, окружающих  ооцит.  Наконец, удалось,  как  бы  синхронизировать  процессы, протекающие  в  яйцеклетке  и  трансплантируемом  в нём  ядре, что  позволило  обеспечить  естественные  ядерно-цитоплазматические взаимоотношения  между  ядром  и  цитоплазмой, поскольку  трансплантируемое  дифференцированное  в  определённом  направлении  ядро  и  цитоплазма  яйцеклетки  до  того  работали  как  бы  в  разных  режимах.        

 Авторы  использовали  для  трансплантации  ядра  клеток, окружающих  ооцит, клеток  Сертоли  из  семенников  и  клеток, выделенных  из  мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в  энуклеированное  яйцо  с  помощью  микропипетки. Яйцо  активировали  к  развитию, поместив  в  специальный  раствор , свободный  от  кальция, и  добавляя  стронций  и  цитохалазин. Стронций  активировал  яйцо, а  кальций  подавлял  образование  полярных  телец. Эмбрионов  культивировали  до  стадии  2-8  клеток, морулы  или  бластулы, а  затем трансплантировали  в  матку  приёмной матери, где  многие из них имплантировались  и  некоторые  из   них  (15-16%)  продолжали  своё  развитие.       

 Процент  выхода  рождённых  мышат (их извлекали с помощью  кесарева  сечения на 18, 19-й дни беременности) был, однако, низок – в  разных  сериях  экспериментов от 2  до  2,8%. Молекулярные  исследования  доказали  принадлежность ядер  рождённых  мышат  к  клеткам  донора  соматических  клеток. Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие  млекопитающих. Но работы  с  мышами, значительно  расширили  наши  представления  о  методологии  млекопитающих.  

 Кролики  и  коровы          

 Американские  исследователи  Стек  и  Робел, используя  метод  Солитера  и  Мак Грата, получили  шесть  живых  кроликов, пересадив  ядра  8-клеточных  эмбрионов  одной  породы  в  лишённые  ядра  яйцеклетки  кроликов  другой  породы. Фенотип  родившихся  полностью  соответствовал  фенотипу  донора.         

 Однако  только  6  из  164  реконструированных  яйцеклеток  (3,7%)  развились  в  нормальных  животных. Это, конечно, очень  низкий  выход, практически  не  позволяющий  рассчитывать  на  получение  таким  способом  клона  генетически  идентичных  животных. Ценность  этой  работы, тем  не  менее,  в  том, что  она  показала  возможность  клонирования  эмбрионов  кроликов.          

 Работа  с  реконструированными  яйцеклетками  крупных  домашних  животных, коров  или  овец, идёт  несколько  по-другому. Их  сначала  культивируют  не  «in  vitro», а «in  vivo» – в  перевязанном  яйцеводе  овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем  их  оттуда  вымывают  и  трансплантируют  в  матку  окончательного  (второго)  реципиента – коровы  или  овцы  соответственно, где  их  развитие  происходит  до  развитого  детёныша. Уиландсин  предложил  заключить  реконструированные  яйцеклетки  в  агаровый  цилиндр, который  он  потом  трансплантировал  в  перевязанный  яйцевод  овцы  или  коровы. По  данным  одних  авторов реконструированные  зародыши  лучше  развиваются  в  яйцеводе, чем  в  культивированной  среде, хотя  некоторые  исследователи  получили  неплохие  результаты  и  при  культивировании  «in  vitro». 

 Американцы  Робел  и  его  сотрудники  использовали  щадящий  метод  извлечения  ядра  без  прокалывания  мембраны  яйцеклетки, предложенные  Мак Гратом  и  Солитером, пересаживали  в  зиготы  так  называемые  кариопласты – мужской  и  женский  пронуклеусы  вместе  с  окружающей  их  цитоплазмой, а  также  ядра  2-, 4-  или  8-клеточных  эмбрионов  коровы.  

Сначала  пронуклеусы  центрифигурировали, чтобы  освободить  пронуклеусы  от  окружающих  их  гранул  желтка, после  чего  ядра  были  хорошо  видны  под  микроскопом, что  значительно  облегчало  их  удаление. При  помощи  манипулятора  и  заострённой  стеклянной  пипетки  извлекали  один  из  бластомеров  вместе  с  ядром  из  ранних  зародышей  и  переносили  его  в  энуклеированную  зиготы    

      Реконструированные зародыши были заключены  в  агаровый  цилиндр  и  пересажены в перевязанный  яйцевод  овцы. Через  пять  дней  культивирования  их  вымывали, освобождали  от  агора  и  исследовали. Реконструированные  зародыши  в  этом  случае  развивались  только  в  тех  случаях, где  зиготы  в  зиготы  пересаживали  пронуклеусы: 17%  таких  зародышей  достигли  стадии  морулы  или  бластулы. Два  зародыша  были  пересажены  второму  реципиенту – в матку коровы и развитие  их  завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров  использовали ядра 2-, 4- и  8-клеточных  зародышей, то  реконструированные  яйцеклетки  не  развивались  даже  до  стадии  морулы.