Генетическая инженерия

Методы  дот- и слот-гибридизации получили свои названия в зависимости от формы анализируемого пятна ДНК на фильтре - округлой или продолговатой, соответственно. Принципиальное отличие этих методов в том, что с меченым ДНК-зондом гибридизуются молекулы ДНК или РНК без предварительной обработки рестриктазами и электрофореза.

Нозерн-блот (Northern-blot) - метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК.

Вестерн-блот (Western-blot), или иммуноблот, - это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами.

Перечисленные виды блот-гибридизации имеют ряд недостатков: необходимость использования хорошо очищенных препаратов ДНК и радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость процедуры. Все это делает данные методы весьма дорогостоящими.

Гибридизация  in situ. Метод гибридизации с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах (т.е. метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК). В настоящее время наиболее широко используется FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization) — вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченные флуорохромами.

Тесты для диагностики на основе ДНК-гибридизации включают:

• размножение (до требуемого титра) организмов, выделенных из исследуемой

пробы;

•    выделение ДНК из организмов-мишеней;

•    выбор ДНК-зонда, специфичного для  данного микроорганизма;

•    выбор системы гибридизации;

•    мечение ДНК-зондов и обнаружение  образовавшихся гибридов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1. Полимеразная цепная реакция это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей.

2.Амплификацию ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C..

3. Для ПЦР необходимы: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

4. ПЦР осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса: Денатурация Ренатурация Синтез

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Ренатурация (Отжиг) Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Синтез (Элонгация) ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C.

Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 100 000 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом.

Контаминация  – попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул нуклеиновых кислот, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты.

Основными видами контаминации являются:

Перекрестная контаминация – кросс-контаминация (от пробы к пробе) происходит в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси и приводит к появлению спорадических ложноположительных результатов

Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются продуктами для реамплификации.

 Контаминация следовыми количествами ампликонов лабораторной посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории, что приводит к появлению систематических ложноположительных результатов.

На данный момент метод  ПЦР широко используется в следующих  отраслях:

1. Медицина, система санитарно-эпидемиологического  контроля

– диагностика инфекций:

z особо опасные и социально значимые инфекции;

z эпидемические инфекции;

z гемотрансмиссивные инфекции;

z оппортунистические инфекции;

z TORCH-инфекции;

z исследование биоценозов;

– диагностика иммунных патологий

– генетические исследования наследственных заболеваний

– определение ГМИ пищевых  продуктов

2. Ветеринария и растениеводство

– инфекционные заболевания

– определение видовой  принадлежности

3. Наука

– генная инженерия, микробиология, генетика и др.

4. Промышленность

– определение биологического загрязнения (санитарный контроль)

5. Судебная медицина

– идентификация личности

Размноженный  in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК в составе векторных молекул.

 

 

  Методы получения трансгенных организмов.

Трансгенными называют организмы, содеожащие фрагменты чужеродной ДНК.

Метод микроиньекции.

У самок вызывают гиперовуляцию после чего проводят спаривание с самцами.  Из самок-доноров выделяют яйцеклетки. В мужской пронуклеус оплодотворённой яйцеклетки иньецируют трансгенную конструкцию. Яйцеклетки имплантируют «суррогатной» матери, которая производит на свет мышей – основателей трансгенной линии.

 

Вирусный  метод.

Эмбрион, находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион, производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний.

 

Эмбриональный метод.

Эмбриональные стволовые клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, культивируют. Трансфицированные клетки идентифицируют методом позитивно-негативной селекции (ПЦР). Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатной» матери. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить трансгенных мышей.

Практическое применение генной инженерии  в различных отраслях народного  хозяйства.

В растеневодстве.

Трансгенные растения это растения с измененным набором генов. Изменения производят для того, чтобы придать растению некоторые полезные свойства: устойчивость к вредителям, морозостойкость, урожайность, калорийность и тому подобное. Так, в Китае еще в 1992 году выращивали табак, который «не боялся» вредных насекомых. Но начало массовому производству модифицированных продуктов положили США, когда в 1994 году появились помидоры, которые не портились при перевозке. И пошло-поехало — генно-модифицированные продукты стали возникать один за другим. В США трансгенная соя вытеснила обыкновенную, появилась трансгенная кукуруза. Разработали вид картофеля, устойчивый к колорадскому жуку, внедрив в него ген бактерии.

Хлеб  с добавлением генетически модифицированных ферментов долго не черствеет. Табак  приобретает устойчивость к ядохимикатам.   Несмотря на то, что в США модифицированные продукты ест практически каждая семья, В России массовое производство трансгенных растений пока запрещено. И все же каждый из нас почти ежедневно сталкивается с трансгенными продуктами в магазине, порой даже не подозревая об этом. Например, покупая колбасы, в состав которых часто входит генетически модифицированная соя.

 

В животноводстве.

В лаборатории  конструируется молекула, содержащая в себе ген, ответственный за синтез нужного гормона. Затем эта конструкция  интегрируется в генный аппарат  животного, организм которого под воздействием своих собственных управляющих  элементов, так называемых промоторов, начинает синтезировать внутри себя эти самые гормоны. Это могут  быть гормоны роста, могут быть инсулиноподобные факторы роста, могут быть гормоны, обладающие другими функциями.

Помимо  синтеза гормонов роста (для быстрого набора массы у мясных пород) в  организме животного можно увеличить  синтез некоторых других веществ, содержащихся, например, в молоке. В Великобритании существует стадо коров, молоко которых  идеально подходит для приготовления  сыра чеддер.

Особо актуальным является создание животных способных продуцировать несвойственные их виду белки. Так, например, сообщалось о разработках направленных на получение  свиней, способных продуцировать  интерферон человека, потребности в  котором в современной медицине достаточно велики. Другим примером являются коровы, способные продуцировать  молоко с лактоферрином (не входящим в состав обычного коровьего молока), использующегося при искусственном вскармливании младенцев.

Создание  трансгенных животных может способствовать решению многих проблем, с которыми человечество сталкивается на всем протяжении своей истории. Это прежде всего продовольственная проблема и проблема создания лекарственных препаратов и их получения в достаточном количестве.

 

В медицине

Диагностика генетических заболеваний

Генная терапия включает следующие этапы:

1) получение клеток от  больного (в генной терапии разрешено  использовать только соматические  клетки человека);

2) введение в клетки  лечебного гена для исправления  генетического дефекта;

3) отбор и размножение  "исправленных" клеток;

4) введение "исправленных" клеток в организм пациента.

Впервые успешно применить  генную терапию удалось в 1990 г. Четырехлетней  девочке, страдающей тяжелым иммунодефицитом (дефект фермента аденозиндезаминазы), были введены собственные лимфоциты со встроенным нормальным геном аденозиндезаминазы. Лечебный эффект сохранялся в течение нескольких месяцев, после чего процедуру пришлось регулярно повторять, поскольку исправленные клетки, как и другие клетки организма, имеют ограниченный срок жизни. В настоящее время генную терапию используют для лечения более десятка наследственных заболеваний, в том числе гемофилии, талассемии, муковисцидоза.

В настоящее время проводится массовый скрининг новорожденных в  роддомах для выявления некоторых  наследственных заболеваний. Данные исследования позволяют поставить диагноз  в ранние сроки и своевременно назначить эффективное лечение.

Пренатальная диагностика наследственных заболеваний.

Больших успехов в последнее  десятилетие достигла пренатальная диагностика наследственных заболеваний и врожденных пороков развития. Широкое распространение в медицинской практике получили следующие методы: ультразвуковое исследование, амниоцентез, биопсия хориона, кордоцентез, определение альфа-фетопротеина и хориогонина, ДНК- диагностика.

Лечение генетических заболеваний

Особые надежды в связи  с этим возлагают на использование  методов генной инженерии для  введения нормальных, неизмененных генов  в клетки больного человека. Таким  путем можно будет добиться кардинального  излечения данного больного, но, однако это дело будущего.

 

Генные  вакцины

Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая уменьшения болезнетворной способности бактерий и вирусов путем направленных мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания.