Генетическая инженерия

 

 Генетической инженерией  называют прикладную молекулярную и клеточную генетику, разрабатывающую приемы экспериментального вмешательства, позволяющие по заранее намеченному плану перестраивать геном организмов, изменяя содержащуюся в нем генетическую информацию.

Формальной  датой рождения генной инженерии  считают 1972 г., когда группа П. Берга в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК (рекДНК), объединившую в своем составе генетический материал из трех источников: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага λ и гены лактозного оперона E. сoli. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована функционально, т.к. у авторов этой работы возникли опасения, что методы генетической инженерии могут привести к возникновению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, например, бактерий Е. сoli, способных перенести онкогенные вирусы в кишечник человека. Поэтому международным научным сообществом было принято решение проводить такие исследования под строжайшим контролем со стороны государства.

 

В понятие генетической инженерии  не включают перестройку геномов  обычными генетическими методами, т.е. искусственным вызыванием мутаций  и получением рекомбинаций путем  скрещивания.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму некие другие свойства.

 

 

Перенос генетического материала (дезоксирибо-нуклеиновой кислоты, ДНК) из одного организма в другой проводят по следующей схеме:

 

1.   Из организма — донора нужных генов  экстрагируют   нативную   ДНК   (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК),  подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирующий вектор—встроенная ДНК»).

 

2.    Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина  (реципиент), где она реплицируется  и передается потомкам. Этот процесс  называется трансформацией.

 

3.    На следующем этапе идентифицируют  и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки), а затем получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

 

    Возможность проведения манипуляций с ДНК зависит от ферментов, которые разрезают, модифицируют и соединяют фрагменты ДНК из разных организмов. Для разрезания молекул ДНК используют ферменты эндонуклеазы, а для соединения фрагментов ДНК используют ферменты лигазы.

 

Ревертаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза) – фермент, синтезирующий ДНК по матрице РНК.

 

ДНК-полимераза – синтезирует нуклеиновые кислоты (ДНК).

 

Терминальная  трансфераза – наращивает на концах фрагментов ДНК однонитевые участки путём последовательного присоединения нуклеотидов; используется для создания на соединяемых фрагментах ДНК «липких» концов.

 

Нуклеазы  – большой класс ферментов, расщепляющих молекулы нуклеиновых кислот; имеются  нуклеазы, расщепляющие одно- или двуцепочечные ДНК или РНК путём отщепления по одному нуклеотиду или небольших олигонуклеотидов.

 

Эндонуклеазы  рестрикции (рестриктазы) – ферменты, которые узнают специфические нуклеотидные последовательности и разрезают молекулу ДНК на фрагменты. Рестриктазы  были обнаружены в бактериальных клетках, они разрезают чужеродную ДНК в определенных участках - сайтах узнавания. Сайты рестрикции (сайты узнавания) – это последовательности ДНК, узнаваемые рестриктазой (обычно 4 – 8 п.н.). В настоящее время известно более 400 видов рестриктаз и более 90 сайтов узнавания.

Особенности рестриктаз:

• Узнают короткие специфические последовательности ДНК
• Разрезают молекулы ДНК с образованием одноцепочечных (липких) или двухцепочечных (тупых) фрагментов.

 

Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты  сшиваемых ДНК.

 

1. Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно-лигазный метод)

Метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году.

Схема рестриктазно - лигазного метода. Рестриктаза Hind III вносит в ДНК симметричные разрывы, образуя однонитевые комплементарные участки (липкие концы). Фермент лигаза используется для соединения фрагментов ДНК. Фрагменты ДНК1 соединяются с вектором (ДНК2) с помощью стандартных 3’ →5’ фосфодиэфирных связей.

2. Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)

Тупые концы также могут быть соединены  за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полом Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза.

3. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами

В ситуации, когда необходимо сшить  фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

 

Векторы в  генной инженерии.

Объединение разных генов в молекуле ДНК бесполезно, если вновь образованные рекомбинантные ДНК не будут реплицироваться (воспроизводиться) в клетке – хозяине. Таким образом, если одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, то другая должна содержать информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Чтобы решить эту проблему используют клонирующие векторы («vector» лат. – переносчик).

Векторы – это молекулы ДНК, способные  соединяться с чужеродной ДНК, переносить ее в другую клетку и обеспечивать репликацию, т.е. воспроизведение. В качестве векторов  генно-инженерных работах чаще всего используют ДНК бактериальных плазмид и вирусы.

Клонирующие векторы должны иметь:

- малый  размер

- хорошую  проницаемость в клеточной мембране

- способность  размножаться в клетке реципиента

- иметь  область в молекуле ДНК, в  которую можно встроить фрагмент  чужеродной молекулы ДНК.

 

Гены и их получение.

Ген (от греч. génos — род, происхождение), элементарная единица наследственности, представляющая отрезок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты — ДНК (у некоторых вирусов — рибонуклеиновой кислоты — РНК). Каждый ген определяет строение одного из белков живой клетки и тем самым участвует в формировании признака или свойства организма.

На данный момент существует множество методов, позволяющие  идентифицировать генетически важные участки ДНК, проложили путь к  разработке исключительно эффективных  методов определения нуклеотидных последовательностей и создания рекомбинантных молекул.

Секвенирование ДНК — представляет собой определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК путем получения серии комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание и позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100 - 500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

Существует два основных метода секвенирования:

1. Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации (1977г) основан на химическом расщеплении ДНК по одному основанию.

 

2. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод "терминаторов" (терминирующих аналогов трифосфатов) 1977г. ферментативный метод.

метод включает следующие этапы:

1) гибридизацию изучаемого  фрагмента ДНК с праймером,

2) ферментативный синтез  ДНК, 

3) денатурацию полученных  продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер),

4) электрофорез в полиакриламидном  геле на четырех дорожках (по  числу типов нуклеотидов) и 

5) анализ результатов на  радиоавтографе.

Автоматическое секвенирование.

При появлении автоматических секвинаторов стало возможным прочитать 25млн пар оснований всего за 4 часа, а весь геном человека ( порядка 3 млрд нуклеотидов) за 100 дней.

В основе автоматического секвенирования - метод Сэнгера.

 

Альтернативные  методы секвенирования ДНК:

-Пиросеквенирование (pyrosequencing), по Ротбергу

-Полони-секвенирование

-Nanopore sequencing 

Принцип метода секвенирования по Ротбергу

Принцип этого метода—секвенирование методом синтеза, оно же пиросеквенирование или секвенирование в реальном времени, — впервые описал в 1988 году Эдвард Химан.

Полони-секвенирование (полимеразная колония).

Использует  очень маленькие фрагменты ДНК, следовательно лучше подходит для повторного чтения.

(А)Амплификация полоний.

Библиотека  линейной ДНК с универсальными сайтами  для посадки праймеров

амплифицируется в полиакриламидном геле. Единичная копия молекулы ДНК дает начало полимеразной колонии (полонии).

(В)  Флюоресцентное секвенирование in situ.

Полонии денатурируют и отжигают праймеры для секвенирования. Полонии

секвенируются путем последовательного добавления отдельных флюоресцирующих нуклеотидов.

Секвенирование с помощью нанопор (Nanopore sequencing)- метод состоит в изменении электрического потенциала при прохождении ДНК через нанопору. Каждая пара оснований ДНК имеет свою неповторимую электрическую «надпись», которую можно идентифицировать, приложив напряжение на золотые электроды нанопоры в то время как ДНК будет находится в ней.

 

Гибридизация  как высокочувствительный метод  выявления специфических последовательностей  нуклеотидов.

 

Если  водный раствор ДНК нагреть до 100оС и повысить рН до 13, то ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65оС вело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК - ДНК, РНК - РНК, ДНК - РНК.

Для теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК(ДНК-Зонд), комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

В большинстве случаев мутации, ведущие  к наследственным болезням, рецессивны, то есть болезнь развивается, если человек получает дефектные гены от обоих родителей.

Анализ  проводят по следующей схеме: исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году.

Метод является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т.д.

 

Одним из наиболее точных и современных  методов анализа является использование  чипов. ДНК-чипы можно применять  для комплексной диагностики  инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех  или иных генов. Они дешевы, очень  надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток – дорогая аппаратура для детекции.

Но  имеется ряд ограничений применения гибридизация с ДНК-зондами.

К основным ограничениям относятся следующие:

-большой размер исследуемых фрагментов, значительно превосходящий длину ДНК-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу;

-невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяющихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК;

-необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной, для геномной гибридизации — наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной активностью, действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока.

К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов, что ограничивает использование методов гибридизации и клонирования для пренатальной диагностики плода (ответ в этом случае надо получить быстро. Однако эти методы не потеряли своей актуальности и используются для картирования и изучения новых генов.

Блот-гибридизация. Это высокочувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. В зависимости от типа изучаемого вещества, способов его предварительной обработки и переноса (блоттинга) различают несколько разновидностей этого метода.