Біофізика білка

2. Формування просторової структури білків 
 
2.1. Принцип самоорганізації просторової структури білка 
     Синтез білкового ланцюга на рибосомі триває близько хвилини. Після цього білок відразу 
ж готовий до функціонування. Це означає, що згортання поліпептиду і формування його просторової структури відбувається дуже швидко. Природно припустити, що згортання білка може починатися ще на рибосомі, до закінчення повного синтезу всієї білкової ланцюга. 
     На жаль, достовірні експериментальні дані про освіту білкової структури in vivo - у клітці - дуже мізерні: дуже важко побачити структурні перетворення зростаючого білка на тлі всієї маси клітинних білків. Зазвичай доводиться зупиняти синтез, виділяти "недороблений" білок, досліджувати його окремо – на все йде час, десятки хвилин, протягом яких просторова структура досліджуваної білкової ланцюга може кардинально змінитися. Подібні досліди з 
великими білками показали, що їхні перші, N-кінцеві, домени встигають (або, точніше, 
володіють здатністю) згорнутися ще до закінчення повного синтезу ланцюга. 
     Цікаві експерименти були виконані з бактеріальною люциферази. 
Люциферази - це фермент, що каталізує реакцію з випусканням світла. Тому освіта готової просторової структури у люциферази легко простежити. Експерименти показали, що після надходження сигналу на оперон з генами люциферази активний білок з'являється через 10 хвилин, а після виключення біосинтезу вихід активного білка відразу припиняється. Це означає, що вже синтезованих, але ще не згорнулися ланцюгів в клітці практично немає. Тобто експеримент показує, що згортання цього великого білка, що містить понад 500 залишків у двох колах, або йде одночасно з його синтезом на рибосомі, або він майже миттєво згортається відразу після кінця біосинтезу. 
     Відомо, що глобулярний білок здатний до спонтанної самоорганізації in vitro 
(Ренатурації), якщо після біосинтезу він не зазнав сильної хімічної модифікації. У цьому випадку його архітектура, "м'яко" (без розриву ланцюга) зруйнована температурою, 
розчинником і т.д., спонтанно відновлюється при "нормалізації" середовища. Щоправда, 
ефективна ренатурація потребує ретельний підбір експериментальних умов. 
     Явище спонтанної самоорганізації білків було відкрито ще в 1961 році на  бичачій рибонуклеазі А. Це відкриття, згодом підтвердили на безлічі інших білків, а також можливість чисто хімічного синтезу білкового ланцюга, спонтанно згортається далі в активний білок, дозволили отримати великий експериментальний матеріал по вивченню формування просторової структури білка in vitro. Взагалі, самоорганізація просторових структур білків (а також РНК) - унікальне фізичне явище, яке не має аналогів в "неживий" природі. 
     Самоорганізація білкових структур ставиться з фізичної точки зору до класу явищ "виникнення порядку з порядку" (за класифікацією Пригожина) і породжується заздалегідь фіксованим порядком ланок у його ланцюзі. Слід відразу відзначити, що самоорганізація просторової структури білків виникає з прагнення молекул до термодинамічної рівноваги. 
     Можна зробити висновок, що все необхідне для придбання просторової структури білка міститься в первинній структурі поліпептиду самого білка. Ніякої додаткової інформації не потрібно. У живій клітині час придбання білком нативної просторової структури порівняти згодом його синтезу на рибосомі.

  2.2. Парадокс Левінталя 
    Труднощі в розумінні самоорганізації білків підкреслюються парадоксом Левінталя. 
      У білковому ланцюзі є велика кількість можливих конформацій, так як кожен амінокислотний залишок має близько 10 можливих конформацій. Це означає, що, наприклад, ланцюг з 100 залишків має близько 10100 можливих конформацій. Так що білок повинен шукати "свою" просторову структуру серед порядку 10100 можливих. Перехід з однієї конформації в іншу займає не менше 10-13 секунди. Перебір всіх 10100 структур мав би зайняти не менше 1080 років, на тлі яких час життя нашого Всесвіту - 1010 років - величина нескінченно мала. Як білок може "знайти" свою структуру за хвилини?Парадокс полягає в наступному. З одного боку, нативна просторова структура за всіма тестами веде себе як найбільш стабільна з усіх структур ланцюга. З іншого боку, придбати цю структуру випадковим чином неможливо. 
      Щоб знайти вихід, Левінталь припустив, що нативна структура білка визначається не стабільністю, не термодинамікою, а кінетикою, тобто вона відповідає не глобальному, а просто швидко досяжному мінімуму вільної енергії ланцюга. 
      Питання про те, кінетика або термодинаміка визначає укладання білкового ланцюга, аж ніяк не розумове. Воно постійно виникає на шляху вирішення конкретних задач фізики білка. 
 
      2.3. Роль шаперонів у формуванні просторової структури білків 
      У клітці білкова ланцюг згортається під опікою спеціальних білків - 
шаперонів.

      "Малі" шаперони зв'язуються з білком, оберігаючи його від агрегації, а потім 
звільняються від нього, на що витрачається АТФ. 
      "Великі" шаперони працюють в основному з баготодоменними білками. Ці шаперони утворюють як би пробірку з кришечкою (діаметром у кілька нанометрів), куди надходить синтезований (і попередньо обліплений малими шаперонами служать гістони) білок або його домен. Ця "пробірка" (іноді її називають "осередком Анфінсен") захищає новонароджений білок і від агрегації, і від дії концентрованого клітинного "супу". При цьому пробірка "трясеться" і час від часу активно відкривається (на що витрачається АТФ) і закривається, але відпускає вона білок тільки тоді, коли він вже згорнеться і перестане липнути до робірки. 
      Крім того, самоорганізація білків може прискорюватися деякими ферментами типу пролив-ізомерази (каталізує повільно саме по собі йде перетворення trans проліну в cis і назад) або дисульфід-ізомерази (каталізує зшивання та розшивка SS-зв'язків). 
 
     2.4. Пріони 
     Однак є приклади, коли формується кілька просторових структур при одній і тій же первинної структурі поліпептиду.Наприкінці XX століття було відкрито білки, що викликають хвороби типу''коров'ячого сказу'', названі пріонами. Потрапляючи в організм, такі білки змінюють шляхи формування просторової структури білка, що синтезується в організмі. Цей білок із зміненою просторової структурою накопичується в клітинах головного мозку і призводить до смерті. 
     Можна припустити, що лише невелика частка з усіх можливих поліпептидів може утворювати стабільні просторові структури і саме ці поліпептиди використовуються живими клітинами. 
 
      2.5. Передбачення і дизайн білкових структур 
      Оскільки вважається, що амінокислотна послідовність білкового ланцюга визначає її просторову структуру, виникає проблема передбачення цієї структури по послідовності амінокислотних залишків у білкового ланцюга. Експериментально просторову структуру білка визначити куди важче, ніж його амінокислотну послідовність. А розуміння механізму дії білка, підбір штучних інгібіторів або активаторів до нього - і часто навіть просто визначення того, чим він займається в клітці, - настійно вимагають знання його просторової 
структури. Якщо встановлених первинних структур білків зараз налічується майже півмільйона, то просторових структур білків - тільки близько 5 тисяч (навіть якщо рахувати разом з близькоспорідненими білками - не більше 15 тисяч). 
      Для встановлення просторової структури невідомого білка часто використовується метод гомології. Використання цього методу грунтується на постулаті: якщо первинні структури схожі, то будуть схожі й просторові структури. Однак надійно даний метод працює на досить близьких послідовностях. Гірше йде справа, коли первинні послідовності сильно варіюють. 
      Як поводитись при пророкуванні просторової структури нових білків, не мають видимої гомології з вже розшифрованими білками? До такої групи відноситься переважна кількість нових послідовностей. Абсолютно надійних і точних методів передбачення білкових структур зараз немає. Це пов'язано з тим, що розрахунки робляться з використанням принципу "мінімальної енергії" для просторової структури, а різниця енергетичних рівнів у білків між "правильно" і "неправильно" укладеними білковими ланцюгами невелика. 
      Однак існуючі та розробляються методи дають все більш повну і надійну інформацію про можливе будові або про можливі варіанти будови білка або його структурних елементів. 
      Великі успіхи досягнуті в прогнозі вторинної структури білків. Таке передбачення носить імовірнісний характер, але тим не менш дає хороші результати. 
      В даний час з розвитком методів генної інженерії з'явилася можливість створювати гени, що кодують білки з будь-якою послідовністю. Оскільки функції білків прямо залежать від їх просторової структури, виникає завдання поліпшення просторової структури для підвищення функціональної ефективності білка. Це завдання - обернена задачі передбачення просторової структури білка з первинної послідовності, тут потрібно знайти первинну послідовність по 
просторовій структурі. 
      Ця задача має важливе прикладне значення. Наприклад, якщо б вдалося зробити потрібні ферменти термостабільними, відкриється нове біотехнологічне напрям отримання ряду речовин. Це тільки невеликий приватний приклад. 
                                                                                  
3. Елементи біофізики білка.  
3.1. Основні завдання біофізики білка  
1. Теоретичні та експериментальні дослідження білкових молекул, а також надмолекулярних систем, які ними утворені.  
2. Встановлення зв'язків первинної структури білка, тобто послідовності амінокислотних залишків, та просторової будови молекул білків.  
3. Вивчення фізичних механізмів біосинтезу білка.  
4. Дослідження фізичних процесів, що лежать в основі біологічних функцій білків.  
3.2. Конформація поліпептидного ланцюга.  
Білки ¬ високомолекулярні з'єднання зі строго певним хімічною будовою. Молекула білка складається з однієї або кількох поліпептидних ланцюгів, утворених в результаті поліконденсації амінокислот. При об'єднанні амінокислот в білкову ланцюг утворюються пептидні зв'язки (-NH-СO-), на одному кінці яких знаходиться NH +3 група, на іншому COO-група.

 
Розглянемо структуру пептидного зв'язку.

 
   
Особливістю зв'язку є те, що 4 атома N, H, C, O розташовуються в одній площині (обведена область на малюнку). З хімії відомо, що обертання в молекулі навколо ординарної зв'язку приводить до появи поворотних ізомерів.  
У білках обертання навколо пептидного зв'язку CN утруднене (енергія активації 40 - 80 кДж / моль), тому що цей зв'язок має характер подвійного зв'язку і, крім того, в пептидного групі має місце водневий зв'язок між групою С = O і атомом водню групи NH (з енергією активації 20-30 кДж / моль).

 
       
Тому білок можна розглядати як ланцюг пов'язаних один з одним плоских пептидних ланок. Обертання цих ланок можливе лише навколо одинарних зв'язків а-вуглецю і амінокислот (див. мал).

   
Кут повороту навколо зв'язку С-С позначається, навколо cвязи С-N позначається.  
Знаходження найбільш стійкою конформації білкової ланцюга вимагає мінімізації її повної енергії, включаючи енергію внутрішньомолекулярних водневих зв'язків. Полінг і Кюрі встановили 2 основні варіанти структури білкової ланцюги, які називаються а-спіраль і-В-форма.  

   Мал.3.1. Орієнтація водневих зв'язків у структурі білка.

 -спіраль може бути правозакручена ( =132^о,  =123^о) і левозакрученной ( =228^о,  =237^о). -форми бувають паралельні ( =61^о,  =239^о) і антипаралельні ( =380^о,  =325^о). 
Крім того, в білках зустрічаються ділянки, що не утворюють жодної регулярної структури. Наприклад, в гемоглобіні 75% амінокислот утворюють правозакручена-спіралі, а решта ділянок ланцюга взагалі ніяк не впорядковані. Впорядковані ділянки часто називають кристалічною частиною білкової молекули, а невпорядковані ділянки - аморфною формою білка.  
Аморфні ділянки - депо будівельного матеріалу, який у разі необхідності використовується для побудови упорядкованих ділянок.  
3.3. Структура води і гідрофобні взаємодії.  
Так як більшість білків функціонує у водному середовищі, то взаємодія складових їх мономерів з водою визначає просторову конформацію макромолекули білка в цілому.  
Розглянемо властивості води більш докладно. Молекула води є диполем через свою асиметрії. У водному розчині атом О2 розташовується як би в центрі тетраедра, у двох вершинах якого знаходяться атоми Н.

 
    Мал. 3.2. Тетраедричних властивості повністю координованої води.  
Дві пари електронів кисню, не беруть участь в утворенні валентного зв'язку, знаходяться на витягнутих орбіталях, осі яких спрямовані до двох вершин тетраедра. Ці електронні пари несуть негативний заряд і притягують атоми водню двох сусідніх молекул, тобто утворюють водневі зв'язки. Завдяки цим взаємодіям в рідкій воді формуються асоціації молекул, які називаються кластерами. Структура кластерів подібна зі структурою льоду. Однак ця кристалічна решітка відрізняється певною "рихлістю" (саме цим пояснюється невисока щільність льоду). Разом з тим, навіть після повного танення льоду в рідкій фазі води зберігаються льодоподібною структури - кластери (розрахунки показують, що якщо б їх не було, то щільність рідкої води була б = 1.8 м / мл, замість 1.0 г / мл). Наявність у воді кластерів підтверджується даними рентгенографічних досліджень. Між неструктурованої водою і кластерами постійно здійснюється обмін молекулами, так що в середньому час життя кластера складає 10-10 с. При 20 оС у воді частка незв'язаних в кластери молекул складає 29.5%. Зі збільшенням температури середній розмір кластера зменшується, і частка незв'язаних молекул зростає (саме плавленням кластерів пояснюється аномально висока теплоємність води).  
У воді добре розчиняються такі органічні сполуки, які містять полярні групи і здатні вступати в диполь-дипольна взаємодія з молекулами води або утворювати з ними водневі зв'язки. Такими, зокрема, є групи:

 
   
Навпаки, неполярні сполуки погано розчинні у воді. Фізичні причини цих явищ були з'ясовані після вимірювання термодинамічних параметрів процесів розчинення. Було встановлено, що у разі поганої розчинності вуглеводнів у воді зміна вільної енергії позитивно, і, отже, ентропія системи зменшується.

 
   
Що ж означає зменшення ентропії при розчиненні?

 
Прямими фізичними дослідженнями було показано, що при цьому відбувається збільшення частки кластерів. При розчиненні молекули вуглеводів втискуються в порожнині всередині тетраедричних осередків кластерів і витісняють звідти неструктуровану воду. Остання утворює нові кластери, і впорядкованість системи збільшується, а значить, ентропія зменшується. Тому гідрофобні взаємодії є результатом властивостей води, а не якихось особливих сил, що зв'язують неполярні групи один з одним. Таким чином, асоціація неполярних молекул у воді за рахунок гідрофобних взаємодій визначається виштовхує дією води на неполярні сполуки, що обумовлено тенденцією молекул води до досягнення стану максимальної невпорядкованості.  
3.4. Гідрофобні взаємодії та структури білків.  
Всі амінокислотні залишки, що входять до складу поліпептидного ланцюга умовно поділяються на дві групи:  
-Неполярні (гідрофобні)  
-Полярні (гідрофільні)  
Ступінь гідрофобності залишку визначають по різниці вільних енергій розчинення амінокислоти в слабополярном розчиннику і воді (зазвичай використовують етиловий спирт).

Отримані таким чином величини різниць вільних енергій, що припадають на білкову групу амінокислоти при перенесенні з спирту у воду, наведені в таблиці:

 
   Назви залишків: глиця, аланіл, валив, Лейца, ізолейцил (мулі), фенілаланіл (фен), пролив, трітофоніл (три), серил (сер), треоніл (тре), метионит (мет), аспарагін (асп), глутамініл ( глн), цистин, аспаргіл, глутаміл (гли), тирозил, гістіділ (гіс), лізил (ліз), аргініл (арг).  
Гіпотеза про визначальну роль гідрофобних взаємодій була доведена в 1944 році. Ідея полягала в тому, що гнучка молекула білка у воді згортається в глобулу (оскільки полярні залишки білка прагнуть до максимального контакту з водним оточенням, а неполярні - до мінімального контакту). З геометрії відомо, що мінімальною поверхнею при заданому обсязі володіє кулю. Прагнення неполярних залишків утворити всередині білкової частини якусь подобу кулястої краплі, а полярних - зосередитися на її поверхні, і призводить до утворення компактного тіла - глобули з гідрофобним ядром і гідрофільної поверхнею.