Получение монозиготных близнецов

2Осеменяют телок ректо-цервикальным методом внутриматочно с использованием обычных инструментов для И.О. Осеменяют животных однократно в течение спонтанного эструса. Не рекомендуется использовать гормональные препараты для синхронизации эструса при использовании разделенной по полу спермы.

3Не рекомендуется использовать сексированную сперму для осеменения коров в связи с низкой оплодотворяемостью, обусловленной инфекционными и гинекологическими заболеваниями. Кроме того, у коров более растянутый во времени процесс овуляции, что также оказывает неблагоприяный эффект на оплодотворяемость.

4Соломинки с сексированной спермой оттаивают при 37˚С в течение 30 секунд.

5Необходимо оттаивать сразу столько доз, чтобы время от оттаивания до осеменения не превышало 15 минут.

Сейчас ученые из компании Cogent широко практикуют оплодотворение

половых гамет in vitro. Схематично процедура получения таких эмбрионов по дням выглядит следующим образом:

0 — выделение ооцитов из фолликулов самки;

0–1 — доращивание ооцитов в специальной среде и подготовка их к оплодотворению;

1 — оплодотворение ооцитов семенем отобранных быков - производителей1–7 — развитие эмбрионов в инкубаторе в специальной

среде;

7–8 — оценка эмбрионов по качеству, определение пола, подготовка к пересадке или замораживание.

Канадские селекционеры рекомендуют ряд параметров, использование которых дает возможность значительно повысить эффективность племенной работы и улучшить воспроизводство стада.

1Телята при рождении должны быть здоровыми, без генетических дефектов, с высокой скоростью роста; их ветеринарное обслуживание — минимальным.

2Отход молодняка от рождения до первого отела — не более 5%. При выращивании телок — максимальное исполь_зование сочных и грубых кормов.

3При высокой скорости роста и достаточной развитости телок срок их осеменения — 14–15 месяцев.

4Возраст первого отела — не больше 27 месяцев. В это время первотелки должны быть не ниже 137 см в холке и иметь живую массу не менее 550–600 кг.

4Межотельный период в стаде — 12–13 месяцев.

5Ежегодное количество осемененных телок — около 40% от числа дойных коров. Сверхремонтный молодняк реализуется для генетического улучшения других стад.

6Желателен «рабочий стаж» коров до 6 лактаций./1/

4 Трансплантация эмбрионов

Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных — био­технологический метод воспроизводства, позволяющий увеличить темпы воспроизводства и повысить эффективность племенной работы. Наиболее приемлемы для трансплантации эмбрионов малоплодные виды животных: коровы, лошади, овцы.

В основе метода трансплантации эмбрионов включена возможность лабораторного манипулирования (вне орга­низма животных) со спермиями, яйцеклетками и эмбрионами. При трансплантации эмбрионов взаимодействуют четыре биологические си­стемы (самец, самка-донор, самка-реципиент и эмбрион - плод - новорожденный). А это обусловливает взаимодействие четырех генотипов со своими индивидуальными иммунными системами./3/

Весь процесс трансплантации (пересадки) эмбрионов состоит из: 1) отбора самок-доноров и самок-реципиентов; 2)формирования множественной овуляции (суперовуляции) у самок доноров и их искусственного осеменения; 3) получения эмбрионов от самок-доно­ров; 4) оценки, культивирования и хранения эмбрионов; 5) синхронизация полового цикла у самок-реципиентов с половым циклом у самок-доноров; 6) пересадки от самки-донора эм­брионов в стадии модулы или бластулы самке-реципиенту.

Отбор коров-доноров, выделенных в группу матерей быков, проводят в два этапа. На первом этапе их оценивают по собственно­му генотипу, на втором этапе по качеству их потомства.

Суперовуляция. Для стимуляции множественной овуляции используют гонатропин СЖК в сочетании простогландинами и другими биологически активными веществами, Этот способ позволяет вызвать суперовуляцию примерно у 70% коров-доноров. Эффективность суперовуляции в большой степени определяется физиологическим состоянием яичников.

Оптимальной считается овуляция, при которой из фолликулов яичника выходит 10.. .20 созревших яйцеклеток.

Искусственное осеменение коров-доноров. Используют сперму выда­ющихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Коров осеменяют дважды в день с интервалом 10... 12 ч каж­дый раз двумя-тремя дозами размороженной спермы.

Извлечение эмбрионов. Эффективность метода трансплантации во многом определяется способом извлече­ния эмбрионов. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров из­влекаются тремя способами; после убоя коровы-донора, хирургическим и нехирургичес­ким. В настоящее время используют для извлечения ранних эмбрионов только нехирурги­ческий способ.

Для вымывания эмбрионов из матки используют чаще гибкий одноходовой катетер Фалея с упругим мандреном и надувным баллончиком. Наполнение матки промывной жид­костью и ее отток контролируют ректально. Вымывание повторяют 5...8 раз. Основную часть эмбрионов извлекают в первых 3...4-х смывках. Промывание в обоих рогах матки, включая введение катетеров, продолжается 20...50 мин. За это время можно извлечь более 50% эм­брионов, находящихся на стадии модулы или бластоцисты.

Собранную промывную жидкость отстаивают 20...30 мин при 20...З0° С, чтобы эмбри­оны опустились на дно. Найденных эмбрионов с помощью пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюлльбено с добавлением 20% фетальной сыворотки крови теленка). После оценки жизнеспособности зародыш культивируют при 37°С для пе­ресадки или оставляют для хранения.

Кратковременное культивирование и хранение эмбрионов. От момента получения эмбрионов до введения их в рога матки реципиента проходит от 1 до 4...5 ч. Кратковременное хранение и культивирование эмбрионов дает возможность транс­портировать их в другие хозяйства. Эмбрионы крупного рогатого скота можно сохранить путем пересадки в яйцеводы-кульчики, где они могут сохраняться 3...4 сут, при этом выжи­ваемость, их сохраняется на 78%.

После извлечения и оценки на жизнеспособность эмбрионы переносят в питатель­ные среды (ТС-199, Хэмо Т-10) для культивирования с температурой 37°С. Для получения оптимальных условий для развития эмбрионов используют газовую среду, содержащую 90% азота, 3% кислорода и 5% углекислого газа. Культивирование эмбрионов в пробирках или соломинках является более простым методом, позволяющим транспортировать эмбрионы на дальние расстояния до 9,5 ч.

Пересадка эмбрионов реципиентам. В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после 2...3-х нор­мальных половых циклов. В среднем на одного донора отбирают 5...6 реципиентов. В каче­стве реципиентов наиболее пригодны полновозрастные тёлки с хорошими племенными кон­дициями, т.к. у них по сравнению с коровами многократная синхронизация полового цикла с помощью простагландинов не вызывает затруднений.

Основным условием хорошего приживления эмбрионов служит синхронность прояв­ления половой охоты у доноров и реципиентов. Разность во времени в проявлении поло­вой охоты не должна превышать 24 ч, оптимальные же результаты получают при разности не более 12 ч.

Пересадка эмбрионов реципиентам производится в основном нехирургическим спо­собом. Основным преимуществом этого способа является возможность многократного ис­пользования реципиента. На 60-е сутки после пересадки эмбрионов реципиентов исследуют на наличие стельности методом ректальной пальпации./2/

5  Клонирование

В 1997 г. группа ученых из Рослинского института в Эдинбурге (Шотландия) заявила о селекционном открытии в области генной инженерии. Без участия половых клеток барана был получен ягненок с выраженными признаками породы финн-дорсет, выношенный и рожденный овцой тотлиндской черноголовой. Эту овечку назвали Долли. Процесс ее зарождения шел так: из клеток вымени 7_летней овцы изъяли ядро с ДНК и с помощью электрического разряда поместили в яйцеклетку другой породы, откуда предварительно удалили собственное ядро. Особая клеточная среда включила процесс развития ядра.

Несколько дней спустя эмбрион был пересажен в матку третьей овцы (тотлиндской черноголовой), которая через положенное время родила ягненка породы финн_дорсет. Таким образом у Долли оказалось три матери и ни одного отца. Биологически же ее родители — овца и баран, зачавшие ту самую овцу, из клетки которой было изъято ядро с ДНК.

Это была отнюдь не первая попытка в истории науки получить генетические копии взрослого организма.

В конце 80_х годов в лаборатории компании ABS (США) родился теленок, полученный в результате клонирования предшественников половых клеток. Это, по-видимому, гораздо эффективнее клонирования из клеток уже взрослой особи. Наука сейчас владеет методами клонирования генов и конструирования на их основе плазмид, обеспечивающих встраивание генов в геном организма реципиента.

Что из себя представляет "настоящее" клонирование. В вкратце процесс состоит в следующем: из клетки тела клонируемого организма, находящегося на стадии постэмбрионального развития, изымается генетический материал – хромосомы содержащие цепи ДНК, пересаживаемый затем в половую клетку реципиента. Этот процесс является наиболее сложным и деликатным. Затем эта половая клетка с введенным в нее чужеродным генетическим материалом – ДНК клонируемого организма, пересаживается в матку реципиента, где проходит все стадии эмбрионального процесса. Исходом такой беременности является рождение генетической копии организма-донора – его клон.

После рождения животного, развившегося из зиготы пересаженной в матку самки-реципиента, выжидается определенное время, когда это животное станет взрослым. После этого, данное животное объявляется "клонируемым". При этом, весь предыдущий этап оказывается "за кадром". "Клонирование" в этом случае заключается в том, что через определенный промежуток времени другому животному-реципиенту в матку пересаживается одна или несколько замороженных "копий" взрослого животного и через некоторое время рождаются "клонированные" близнецы. /6/

6 Получение трансгенных животных

Цель сегодняшних исследований — преодоление биологических преград между видами животных и использование межвидовой генетической изменчивости для создания новых форм. Это возможно только путем переноса генов, то есть пересадки in vitro рекомбинационной конструкции гена в клетки другого животного вне зависимости от его видовой принадлежности, что позволит преодолеть бесплодие при гибридизации.

Все методы переноса генетической информации млекопитающих охватывают ранние этапы онтогенеза — от оплодотворения яйцеклетки до формирования бластоцисты, способной имплантироваться в матку реципиента.  Для переноса генов применяют методы микроинъекции рекомбинантных ДНК в пронуклеус зиготы и ретровирусы (с помощью векторов)./5/

Первоначально трансгенных животных получали на лабораторных животных, где пол­но разработаны микрохирургия зигот и ранних зародышей, методы культивирования ооцитов и ранних эмбрионов. Пересадка реципиентам эмбрионов, развитие которых про­ходило в культуральных средах, приводит к высокому уровню их имплантации и рождению потомства. Полученное потомство с помощью генетических маркеров точно идентифициру­ется как трансгенные.

Техника микроинъекции ДНК сводится к тому, что в оплодотворённую яйцеклетку вво­дят ген, контролирующий определённый признак, с помощью микропипетки диаметром 1 мкм после микроинъекции зиготы.

Зиготы с чужеродной ДНК хранятся примерно в течение 1 часа. После микроинъекции в течение не более 1 часа проводят селекцию зигот с чужеродной ДНК, и полноценные зиготы трансплантируют в ампулу яйцепровода гормонально подготовленной самки-реци­пиента другой генетической линии.

Схема получения трансгенных сельскохозяйственных животных состоит из последу­ющих этапов:

- выбор, изготовление и клонирование чужеродного гена;

- получение зигот и выявление пронуклеусов;

- микроинъекция определенного числа копий генов в видимый пронуклеус;

- трансплантация зиготы в половые пути гормонально подготовленной самки;

- оценка полученного приплода по генотипу и фенотипу - интеграция чужеродной ДНК, обнаружения продукта гена (например, гормон роста человека) и влияние на признак (на­пример, высокая интенсивность роста);

- установление наследственного гена,

В овцеводстве наиболее эффективным оказался метод микроинъекции в зиготу гена, ответственного за синтез гормона роста овец. Такие эксперименты провели австралийские ученые, создавшие впервые в мире транс генных овец.

Этот дополнительный прием привел к более интенсивному синтезу гормона роста. Через 2.. .4 года трансгенных овец в 1,5 раза превосходили поживой массе сверстников той же породы.

На основании проведенных исследований, выявлено, что часть появления трансгенныхсвиней составилна10..,14%.

Исследования по получению трансгенных животных у крупного рогатого скота пока не привели к получению трансгенного потомства.

Трудности получения трансгенных животных крупного рогатого скота связано с их био­логической особенностью. В отличии от многоплодных животных у них не разрешена пробле­ма получения достаточного числа биологически полноценных яйцеклеток и зигот.

7  Получение химерных животных

Одно из перспективных направлений микроманипуляций на эмбрионах — получение химер (генетических мозаик), то есть приплода, родившегося в результат пересадки зародыша, состоявшего из клеточной массы двух или нескольких эмбрионов и объединенных в одно целое. Сейчас уже есть химеры, объединяющие 16 эмбрионов./6/

Принципиально возможны два подхода к искусствен­ному получению химер. Первый подход заключается в по­лучении химер методом инъекции в эмбрион группы кле­ток от другого эмбриона. В этом случае получают так называемых инъекционных химер. При такой микрома­нипуляции можно в эмбрион вносить клетки как одного, так и другого вида животного. Так, в эмбрион мыши бы­ли введены клетки человека. Полученная химерная мышь в своем генотипе несла гены человека. Второй подход для получения химер основан на слиянии клеточной массы двух или нескольких эмбрионов внутри одной зоны пеллюцида. Этим методом можно получить агрегационные химеры. Метод состоит в том, что 8-клеточные эмбрионы инкубируют в среде с протеолитическим ферментом, переваривающим оболочки яйце­клетки. Освобожденные от оболочек эмбрионы соприка­саются между собой, в результате чего их клетки слива­ются и перемешиваются.