Получение монозиготных близнецов

1 Получение монозиготных близнецов                                                                                                                            

Близнецов можно разделить на два типа - двуяйцовые, или дизиготные, и однояйцо­вые или монозиготные. Следовательно, природа близнецов является двойственной. Так двуяйцовые близнецы возникают в результате оплодотворения двух яйцеклеток разными спер­матозоидами. Вероятность рождения разнояйцовых близнецов считают обусловлена мно­жественной овуляцией или полиовуляцией, характерной для многоплодных животных,

Возникновение монозиготных близнецов считают происходит на основе разделения зиготы на две части на ранних стадиях дробления. При этом исходят из того, что ядро каж­дого бластомера по своим потенциям развития идентично ядру зиготы. Следовательно, все соматические клетки, сформированные из зиготы в процессе развития эмбриона обладают одинаковым набором хромосом. Другими словами, возникновение монозиготных близне­цов связано с клонированием генотипов. Принципиальный механизм спонтанного возник­новения монозиготных двоен может быть использован для искусственного получения одно­яйцовых двоен, представляющих собой генетические копии.

Следовательно, искусственное получение однояйцовых близнецов на основе мик­романипуляции с ранними эмбрионами находит в воспроизводстве сельскохозяйственных животных большое практическое значение.

Первые работы по искусственному получению идентичных двоен у млекопитающих на основе микроманипуляций с разными эмбрионами на двухклеточной стадии развития были проведены на кроликах. При этом было доказано, что каждый изолированный эмбрион способен развиваться в полноценных организмах. Из трансплантированных половинок зи­готы были получены живые кролики. Проведённые многочисленные эксперименты показа­ли, что разделение зиготы на два самостоятельных эмбриона может произойти на стадии морулы или ранней бластоцисты. Полученные результаты были проверены на сельскохо­зяйственных животных - овцах, крупном рогатом скоте и свиньях с одновременным усовер­шенствованием техники деления эмбрионов, находящихся на стадиях морулы и бластоцис­ты. Хорошие результаты по пересадке половинок эмбрионов были достигнуты американс­кими учёными, которые получили среднюю стельность коров-реципиентов 60%.

В результате проведённых исследований был разработан простой для практического использования метод получения однояйцовых двоен. В соответствии с этим методом 6,5.. .8 сут эмбрионы находятся в стадии морулы или бластоцисты, разрезают и после упаковки половинок в свободные прозрачные оболочки трансплантируют гормонально подготовлен­ным самкам-реципиентам. Доказано также, что возможно трансплантировать половинки эмбрионов без упаковки их в прозрачную оболочку. Для деления эмбрионов требуется лишь один микроинструмент. На деление одной бластоцисты затрачивается всего одна минута. При этом наиболее пригодными в практике животноводства для трансплантации являются половинки эмбрионов 8-суточного возраста./2/

2 Раннее определение пола у эмбрионоДля определения пола эмбрионов, находящихся на предымплан-тационных стадиях развития, разработаны четыре метода: цитогенетический; иммунологический; идентификации У-хромосомы с по­мощью зондов ДНК (генно-инженерный); определение сцепленных с Х-хромосомой ферментов (биохимический).Цитогенетический метод. Он основан на идентификации половых хромосом в клетках трофобласта эмбриона. Метод включает ряд по­следовательных микроманипуляций: микробиопсию трофобласта эмб­рионов, находящихся на стадиях морулы или бластоцисты; приготов­ление препаратов хромосом; микроскопирование препаратов; кратко­временное хранение исследуемого эмбриона после микробиопсии до трансплантации реципиенту.Для хромосомного анализа необходимо извлечь из трофобласта 12— 15-суточного эмбриона коровы 40—50 бластомеров.Результаты исследований показали, что у крупного рогатого скота для определения пола эмбриона можно использовать цитогенетиче­ский метод, поскольку половые хромосомы X и У отличаются по морфологическим признакам. Однако митотический индекс у 7-суточных эмбрионов существенно варьирует (0-10%) по сравнению с таковым у разных эмбрионов. Поэтому результативность цитогенетического метода во многом зависит от доли митоза. Это связано со значитель­ным увеличением времени культивирования взятых на исследование бластомеров. Общие затраты времени на определение пола составля­ют 24—28 ч, что отрицательно сказывается на жизнеспособности эмб­риона. Эффективность метода 60—65 %.

Иммунологический метод. К перспективным направлениям ис­следований в определении пола ранних эмбрионов относится иммуно­логическая биотехнология. Установлено, что на поверхности клеток эмбрионов мужского пола в отличие от женских находятся специфи­ческие белки H - У- антигены. Гены этих специфических для мужско­го пола белков находятся только в Y-хромосоме.

Можно сказать, что H – Y -антигены выступают в роли генетиче­ских маркеров мужского пола. Однако обнаружить эти антигены очень трудно. Сложность идентификации H – Y -антигенов заключается в том, что реакция образования антител в ответ на введение типичного анти­гена гетерогенна. Использование в стандартных наборах обычных анти­сывороток к поверхностным белкам эмбрионов, как показали иссле­дования, не является эффективным методом определения H - У-антигенов. Лишь после разработки способа конструирования гибридом, производящих высокоспецифические антитела, последние стали эф­фективно использовать для разделения и очистки антигенов.

Так, использование флюоресцирующих моноклональных Н-У-антител против H - У-антигенов позволяет выявить их у эмбрионов, находящихся на 8—16-клеточной стадии развития. Точность метода 80-85 %. Продолжительность определения 2—3 ч.

Идентификация У-хромосомы с помощью зондов ДНК. Суть этого метода заключается в следующем: из морулы или ранней бластоцисты берут 10-15 клеток. Из них извлекают ДНК и анализируют ее с по­мощью Y-специфического, радиоактивно маркированного зонда. Точ­ность метода для оценки пола эмбрионов крупного рогатого скота 95-100%.

Недостаток метода в том, что для определения пола необходимы большие затраты времени (8—10 суток). Поэтому эмбрионы нужно замораживать.

По оценке специалистов, метод определения пола эмбрионов с помощью специфических для У-хромосомы зондов ДНК наиболее перспективен в животноводстве, особенно в скотоводстве. В 1987 г. в США были получены телята с заранее пргнозируемым полом. Пол эмбрионов определяли по наличию или отсутствию У-хромосомы с помощью зондов ДНК. У всех 32 плодов, извлеченных из коров-ре­ципиентов на 60-й день стельности, пол соответствовал результатам предварительного анализа зондом ДНК.

Определение сцепленных Х-хромосомой ферментов. Этот метод определения пола эмбрионов млекопитающих основан на установлении метаболической активности сцепленных с Х-хромосомой фермен­тов. На эмбрионах мыши с помощью колориметрического теста была установлена метаболическая активность фермента глюкозы-6-фос-фатдегидрогеназы. Тест активности данного фермента проводят в те­чение 2 ч без отрицательного влияния на жизнеспособность эмбрионов. Точность метода 60—70 %./4/

3 Использование сексированного семениВ конце XX века в США, в лаборатории ХУ Incorporation, была разработана методика разделения семени по полу. Она основывается на том, что половые гаметы (спермии) быков содержат гаплоидный набор хромосом. То есть одни половые гаметы несут Х_хромосому, а другие — У, и они содержат ДНК на 4% меньше, чем сперматозоиды с Х -_хромосомой. После окрашивания хромосом выявили, что гаметы с х поглощают на 4% больше специального флуоресцентного красителя, от количества которого зависит уровень свечения, возникающего при прохождении потока спермиев через лазерный источник света и улавливаемого компьютером. Когда поток спермиев пропускается через биметаллические пластины с разной полярностью, сперма сортируется на х_ и у_содержащие половые гаметы соответственно их заряду./6/

В качестве флуоресцентного витального  красителя используют нетоксичный краситель Hoechst 33342, Sigma-Aldrich, Munchen, Germany.

Разделяемая по полу сперма проходит через проточный цитометр под определенным давлением. При этом создаются такие условия, чтобы отдельный сперматозоид содержался в одной капле раствора. Лазерное приспособление улавливает разницу в интенсивности флуоресцентного свечения и заряжает капельки со сперматозоидами отрицательным или положительным зарядом в зависимости от интенсивности свечения. После этого капельки проходят через магнитное поле и разделяются на положительно и отрицательно заряженные частицы, которые поступают в различные емкости и содержат преимущественно сперматозоиды с X или Y хромосомой. Поврежденные сперматозоиды или неокрашенные посторонние частицы имеют нейтральный заряд  и поступают в отдельную емкость.  

     Для заготовки  разделенной спермы от быка получают 2 эякулята. Эякуляты предварительно подвергаются строгой оценке по биологическим и санитарным показателям. Они разбавляются патентованным Трис-содержащим разбавителем без желтка, в состав которого вводятся антибиотики: тилозин (100 мкг/мл), гентамицин (500 мкг/мл) и линко-спектин (300 мкг/мл). Затем добавляют специальные красители и выдерживают сперму в течение 30-45 минут при 30˚С для проникновения красителя внутрь клеток. Затем производят сортировку половых клеток с помощью проточной  цитофотометрии  при 18˚С. Скорость разделения клеток составляет 35 тысяч сперматозоидов в минуту. В замороженной сексированной дозе для осеменения (0,25 мл) содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов быка.

     Ceксированную сперму  замораживают в соломинках объемом 0,25 мл. С целью отличия такой спермы от обычного семени, АВS наносит на сексированные  соломинки код 529, а обычную сперму маркируют кодом 29. Кроме того, сперма   предназначенная для получения самок замораживается в красных соломинках, а самцов - в синих соломинках

      После криоконсервации сексированная сперма проходит строгую оценку по концентрации клеток в дозе, подвижности сразу после оттаивания (не менее 40 %), подвижности через 3 часа инкубации при 30˚С (не менее 30 %) и сохранности акросом (не менее 70 % сперматозоидов с интактной акросомой). Браковка сексированной спермы  после криоконсервации по биологическим показателям составляет около 15 %. Также сексированная сперма подвергается санитарной оценке в течение 24 часов после оттаивания согласно требованиям Евросоюза. При этом допускается содержание в одной дозе не более 300 не патогенных микробных тел. Не допускается содержание в сперме грибов и дрожжей, а также кишечной палочки. По санитарным показателям бракуется  0,5% доз спермы.

     Средняя оплодотворяемость телок сексированной спермой  при однократном осеменении в течение эструса может достигать  40 %, а выход потомства желаемого пола составляет  90 %. Считается, что средняя оплодотворяемость телок сексированной спермой составляет 80 % в сравнении с оплодотворяемостью, получаемой в хозяйстве от обычной спермы при однократном осеменении./5/

Компания Cogent первой в мире стала использовать метод разделения семени быков_производителей по полу, создав лабораторию поточной цитометрии.

Эта методика позволяет получать не только семя желательного пола, но и отбирать для глубокого замораживания здоровые, безо всяких аномалий сперматозоиды. Кроме того, при такой технологии можно разбавлять семя так, чтобы в каждой полипропиленовой соломинке содержалось 4 млн спермиев.

Ежедневная мощность лаборатории — 800 спермодоз. Эффективность методики — 90% особей желаемого пола. Если соотношение полов (1:9) не выдерживается, фермеру либо возвращают деньги, либо он получает обычное семя на ту же сумму./3/

Племенная  станция по искусственному осеменению крупного рогатого скота  ABS Global была организована в США в 1941 году   Пренсисом  Рокефеллером  в штате Висконсин , город  Де Форест. В настоящее время она считается одной из крупнейших станций в мире и имеет несколько филиалов: в Канаде, Австралии, Англии, Италии и Бразилии. Непосредственно на станции в  Де Форест в настоящее время содержится около 1000 быков различных пород. В том числе 200 оцененных  рабочих быков, от которых получают сперму  и 800 бычков, которые проходят оценку по качеству потомства и не используются для заготовки семени. Средний период времени оценки быков составляет 4 года. Стоимость содержания одного проверяемого быка составляет 100 тысяч долларов в год. После окончания проверки 90% проверяемых быков выбраковывается.

В течение года от оцененных быков на станции Де Форест  замораживается до 12 млн доз спермы,  из которых 2 млн доз мясных пород и 10 млн - молочных. От молодых бычков, предназначенных для проверки по качеству потомства, предварительно заготавливается 2000 доз семени. Оцененные по качеству потомства быки-улучшатели  используются для получения спермы в среднем в течение 2-3 лет. При этом от быка получают до 80 тысяч доз семени в год.

     В настоящее время сперма молочных  и мясных быков с фирмы АВS Global поставляется в 100 стран мира. С 2004 года сперма из этой фирмы поставляется и в Россию. За время работы фирмы практически не было получено от потребителей рекламации на качество спермы. Это объясняется строгим биологическим и санитарным контролем за качеством спермы. При этом используют современную приборную базу и соответствующие общепринятые методики. Санитарный контроль нативной и криоконсервированной спермы осуществляется независимой государственной организацией.

    С 2006 года эта  компания приступила к заготовке и реализации разделенной по полу спермы быков. Из общего количества заготовляемой спермы, получают до 600 тысяч доз сексированной спермы в год. Эта сперма экспортируется в 75 стран мира.

    Первое коммерческое применение сексированной спермы в скотоводстве началось в 2000 году. К настоящему времени во всем мире получено более 2 млн телят от сексированной спермы.

    Основным патентообладателем на способ получения сексированной спермы является американская фирма  Sexing Technologies, Navasota, Texass.

    Для получения высоких результатов  при искусственном осеменении крупного рогатого скота разделенным по полу семенем необходимо выполнять ряд условий:

1Желательно использовать сексированную сперму только для осеменения телок в хозяйствах, благополучных по инфекционным заболеваниям. В случае неблагополучия хозяйства по инфекционным болезням (ИРТ, вирусная диарея, лептоспироз), телок предварительно за 1 месяц до осеменения вакцинируют поливалентной вакциной (желательно использовать американскую вакцину Pfizer).