Дезинфекция

В стерильном боксе на предметные стекла наносят тонкий слой расплавленной питательной среды: для выделения группы бактерий кишечной палочки используют агар Эндо, стафилококков - 8,5%-ный солевой мясопептонный агар (рН 7,2-7,4). Количество нанесенной среды должно соответствовать 0,15 см' (четыре капли) для узкого предметного стекла и 0,33 см^! (восемь капель) для широкого. Перед нанесением на стекло среду, находящуюся в пробирках, ставят в водяную баню и расплавляют. Затем в нее погружают стерильную пастеровскую пипетку. Температуру воды в бане поддерживают в пределах 80-90°С.

Прогретые над пламенем горелки предметные стекла (берут корнцангом) раскладывают на ровной, строго горизонтальной поверхности стола. На них пипеткой наносят указанное количество питательной среды, отступив на 2-2,5 см от поперечного края стекла. Затем, расположив горизонтально пастеровскую _ пипетку, питательную среду быстро распределяют по средней трети поверхности стекла и подсушивают при комнатной температуре до появления вокруг питательной среды высушенной полосы шириной 0,5-1 мм. Широкие стекла со средой помещают в пластмассовые ванны, узкие - в пробирки. Ванны и пробирки предварительно увлажняют путем внесения на дно 1см^! 0,1 см¹ стерильной водопроводной воды соответственно. Для удобства транспортировки ванны устанавливают в бюксы, пробирки - в металлические пеналы или специально приспособленную сумку. Подготовленные предметные'стекла с солевым агаром хранят при температуре 4°С до десяти суток, со средой Эндо - двое-трое суток (если нет видимого изменения цвета среды).

При подготовке стекол для микроскопирования микобак-терий предметные стекла разрезают вдоль на узкие полоски размером 1,2«7,5 см, моют и помещают на 2 ч в хромпик (40 г двух-ромовокислого калия высыпают в фарфоровую кружку или эксикатор и растворяют в небольшом количестве воды, затем осторожно добавляют концентрированную серную кислоту до общего объема 1л). После хромпика стекла вновь моют дистиллированной водой, протирают чистой льняной тканью, стерилизуют сухим жаром (160°С) 2 ч и хранят в закрытых сосудах (эксикаторах).

Предметные стекла с нанесенной средой извлекают корнцангом из ванн или пробирок, не касаясь застывшей питательной среды, и накладывают на исследуемый объект таким образом, чтобы питательная среда соприкасалась с его поверхностью. Через 2 мин пробы-отпечатки отделяют от контролируемого объекта и помещают в ванны или пробирки, в которых их транспортировали. При взятии проб с труднодоступных или вертикальных поверхностей время контакта слоя питательной среды с объектом сокращают до 30 с.

Смывы должны быть доставлены в лабораторию в течение 3-6 ч с момента взятия, отпечатки - не позднее 2 ч.

Методы бактериологического исследования смывов. Пробы (каждую в отдельности) отмывают в той же пробирке путем нескольких погружений и отжатий тампона. Последний удаляют, а жидкость центрифугируют 20-30 мин при 3000-6500 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливают, в пробирку наливают такое же количество стерильной воды, содержимое смешивают и снова центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а из цент-рифу гата делают посевы. При наличии в смыве грубых механических примесей их растирают в пробирке стеклянной палочкой, после чего смыв переносят в центрифужную пробирку.

Для индикации кишечной палочки 0,5 см'^! центрифугата высевают в пробирки с модифицированной средой Хейфеца (к 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия'и 4 г лактозы). Смесь доводят до кипения, фильтруют и после отстаивания определяют показатель рН, который должен быть 7,4-7,8. Затем к среде добавляют,в качестве индикатора 1 см^:! 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты и 2,3 см' 0,1%-ного водного раствора метиленовой сини. Среду разливают в пробирки по 5 см^! и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 15 мин. Исходный цвет среды красновато-сиреневый, или КОДА.

Посевы выдерживают 12-18 ч в термостате при температуре37~38°С. Изменение сиренево-красного цвета среды (в зеленый или салатовый) с помутнением и образованием газа свидетельствует о наличии роста кишечной палочки. Другие изменения цвета (желтоватый, розовый, сероватый), наблюдаемые при росте микроорганизмов других видов, не учитывают. В сомнительных случаях делают подтверждающий посев с жидких сред на агар Эндо. Посевы инкубируют 12-16 ч при температуре 37-38°С.

Для индикации стафилококков 0,5 см^:) центрифугата высевают в 5 мл мясопептонного бульона с 6,5% хлористого натрия. Через 22-24 ч инкубирования посевов при температуре 37-38°С делают пересевы бактериологической петлей на 8,5%-ный солевой мясопептонный агар. Посевы выдерживают в термостате 22-24 ч при температуре 37-38°С. Из выросших культур для подтверждения роста стафилококков готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для индикации спорообразующих аэробов смывы обрабатывают, как указано выше, но перед центрифугированием их прогревают 30 мин на водяной бане при 65°С. Из центрифугата каждой пробы делают посевы в одну пробирку с мясопептонным бульоном (МПБ) и на две чашки с мясопептонным агаром (МП А). Для контроля качества дезинфекции при сибирской язве МПА может быть заменен дифференциально-диагностической средой:

для приготовления растворов ингредиентов полимиксин М сульфат во флаконе растворяют в стерильной дистиллированной воДе, затем последовательными разведениями стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида доводят до концентрации 10000 ЕД/см¹;    ,

невиграмон переносят в стеклянный флакон или пробирку и растворяют в 25%-ном растворе аммиака при тщательном перемешивании стеклянной паяочкой. Затем последовательно разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до. концентрации 100 мкг/ см¹;

моющее средство "Прогресс" растворяют стерильной дистиллированной водой до 0,1%-ной концентрации;

гризеофульвин (в таблетках) тщательно растирают в ступке, затем растворяют в стерильной дистиллированной воде до содержания 100 мкг препарата в 1 см^!;

фенолфталеинфосфат натрия (заводской 10%-ный раствор) стерилизуют 30 мин на водяной бане при 56°С.

При приготовлении дифференциально-диагностической среды 100 см'¹ питательного агара (в колбах) расплавляют в кипящей водяной бане и охлаждают до температуры 45-50°С. За-тем в агар добавляют 0,5 ем^:! полимиксина М сульфата, столько же невиграмона, гризеофульвина, такое же количество моющего средства "Прогресс" и 0,1 см'' фенолфталеинфосфатанатрия. После перемешивания среду разливают в чашки Петри (крышки открыты) и подсушивают 1,5-2 ч. Дифференциально-диагностическую среду после разлива можно хранить в холодильнике в течение одних-двух суток). Посевы инкубируют 24-48 ч в термостате при 37°С.

При наличии роста на МПА подсчитывают колонии и изучают морфологию их при малом увеличении микроскопа. В случае возникновения подозрения на выделение возбудителя сибирской язвы идентификацию такой культуры проводят в порядке, предусмотренном действующими методическими указаниями.

При наличии роста на дифференциально-диагностической среде в крышку чашки Петри вносят 1-2 см¹ культуры при 20+2°С в течение 1 мин, после чего визуально или под малым увеличением микроскопа проводят учет теста. Под действием паров аммиака происходит порозовение колоний микроорганизмов, обладающих фосфатозной активностью. Bac.anthracis фос-фатозной активностью не обладает и его колонии остаются бесцветными. При отсутствии роста или характерных колоний на плотных средах и наличии роста на МПБ делают дробные посевы из МПБ на плотную питательную среду.

При просмотре посевов учитывают общее число проб, в которых обнаружен рост санитарно-показаТельных микроорганизмов, а при споровой инфекции - и колонии непатогенных спорообразующих аэробов рода Bacillus.

Метод отпечатков на тонком слое плотной питательной среды наиболее приемлем в условиях промышленного ведения животноводства на комплексах, птицефабриках и других объектах, где имеются лаборатории.

Ванны и пробирки с пробами-отпечатками, доставленные в лабораторию, помещают на 16-18 ч в термостат при температуре 37°С. После инкубирования пробы просматривают невооруженным глазом на наличие роста.

При отсутствии микроколоний и изменения среды пробы дальнейшим исследованиям не подвергают. В сомнительных случаях, когда отсутствует рост макроколоний, но изменены цвет или прозрачность среды, фиксируют над пламенем, окрашивают по Муромцеву и микроскопируют с целью обнаружения микроколоний. Учитывают общее число отпечатков, в которых обнаружен рост микроорганизмов.

Контроль качества заключительной дезинфекции при туберкулезе проводят параллельно двумя методами по выделению стафилококка и микобактерий.

Смывы обрабатывают, как указано выше. Из центрифуга-та каждой объединенной пробы делают высев на среды для выделения стафилококков, готовят по шесть мазков на узких (1,2^Х7,5 см) предметных стеклах. Мазки высушивают при комнатной температуре или в термостате 2-3 ч, складывают по два тыльной стороной и погружают в 8-12%-ный раствор серной кислоты на 15 мин. После этого стекла-мазки берут пинцетом и погружают на 5-10 с в стерильную дистиллированную воду, а затем переносят в пробирки со средой Сотона (в 940 см* дистиллированной воды растворяют 4 г аспарагина, 2 - лимонной кислоты, 0,5 - калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 -сернокислой магнезии и 0,05 г лимоннокислого аммиачного ' железа). Затем добавляют 60 см¹ нейтрального глицерина. После полного растворения аспарагина и солей показатель рН среды должен быть 7,4. Среду разливают по 200 см¹ в колбы вместимостью 250 см¹ и стерилизуют 30 мин в автоклаве при 1,5 атм. Перед использованием в колбу со средой Сотона добавляют 30 см¹ стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота, разливают в стерильные пробирки по 7-8 см¹ и помещают на 12 суток в термостат при 37-38°С.

Пробы почвы с прилегающей территории и соскобов с поверхности помещений (каждую в отдельности) помещают в колбу, заливают двух- или трехкратным количеством дистиллированной воды, взбалтывают и фильтруют через двойной слой марли в узкогорлую колбу вместимостью 200-250 см^а. К фильтрату добавляют 2-3 см^! ксилола или авиационного бензина, встряхивают 15-20мини дол ивают дистиллированную воду до горлышка. Содержимое отстаивают 30 мин с целью получения флотата, из которого готовят мазки на узких предметных стеклах.

При наличии роста стафилококков хотя бы в одной исследованной пробе качество дезинфекции признают неудовлетворительным и дальнейшее исследование по выделению микобактерий не проводят.

Стекла с мазками извлекают из пробирок на 6-, 8- и 12-й день инкубирования, высушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Циль-Нильсену и микроскопируют для обнаружения микроколоний.

Оценка результатов исследования. Качество профилактической дезинфекции помещений для получения и содержа-ния молодняка скота (птицы) и текущей дезинфекции изолированных секций (боксов, скотных дворов) с автономной системой жизнеобеспечения животных признают удовлетворительным при отсутствии роста санитарно-показательных микроорганизмов в 90% исследованных проб.

При профилактической дезинфекции помещений для содержания взрослого поголовья и текущей дезинфекции частично освобожденные от животных или неизолированных помещений допускается выделение санитарно-показательных микроорганизмов из 20% исследованных проб.

Качество заключительной дезинфекции при ее контроле по выделению бактерий группы кишечной палочки, стафилококков, грибов и микобактерий признают удовлетворительным при отсутствии выделения названных культур во всех исследованных, пробах.

При споровых инфекциях качество дезинфекции признают удовлетворительным при отсутствии роста Вас. anthracis. 11ри прямом посеве на МП А допускают рост единичных (не более трех в смыве) колоний непатогенных спорообразующих аэробов рода Bacillus.

Метод контроля качества профилактической аэрозольной дезинфекции, проводимой формалином, предназначен для быстрого (непосредственно после окончания экспозиции дезинфекции) контроля качества дезинфекции животноводческих помещений. Он основан на окрашивании индикаторной среды под воздействием газовой и капельной фаз аэрозоля формальдегида. В качестве индикатора используют среду Эндо, которая под воздействием формальдегида в процессе аэрозольной дезинфекции приобретает резко очерченное окрашивание. Перед проведением дезинфекции подготавливают индикаторные пробирки (стеклянные трубки диаметром 4-8 мм и длиной 40-50 мм). В качестве таких пробирок могут быть использованы пробирки Уленгута или отрезки пипеток, запаянные с одного конца. Пробирки заливают расплавленной индикаторной средой до уровня обреза пробирок, запечатывают парафином и хранят 1 мес (со дня изготовления) при температуре 0-5°С. Для учета результатов без линейки на индикаторные пробирки при их изготовлении можно нанести риски на расстоянии 18 и 30 мм.от среза пробирки. Для экспресс-метода контроля качества аэрозольной дезинфекции помещений используют среду Эндо, выпускаемую биологической промышленностью в сухом виде; 2%-ную взвесь сухой среды в дистиллированной воде доводят до кипения и про-пускают через ватный фильтр, после чего среду заливают в пробирки при помощи пипеток, наносят на пол, стены, потолок помещения и находящееся в нем оборудование. Особо важно прикрепить индикаторные средства в труднодоступных местах (внутри оборудования, у щелей и т.д.). На одно помещение требуется в среднем 10-15 пробирок. Перед размещением с пробирок снимают парафиновые колпачки. На полу помещения пробирки устанавливают, а на стенах прикрепляют открытым концом вверх, на потолке фиксируют открытым концом вниз.