Пастереллез

    3.1 Особенности взятия и пересылки  патологического материла 

    Диагноз на пастереллез устанавливают на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологических и лабораторных исследований.

    Лабораторная  диагностика пастереллеза предусматривает: 1) микроскопию мазков из крови и мазков-отпечатков из пораженных органов; 2) выделение чистой культуры на питательных средах с идентификацией по биохимическим свойствам; 3) выделение пастерелл путем заражения лабораторных животных (белых мышей или кроликов) суспензией из патологического материала и культурой из питательной среды; 4) определение вирулентности выделенных культур для белых мышей и кроликов. Для определения вирулентности гемолитической пастереллы используют 7-дневные куриные эмбрионы; 5) определение серовариантной принадлежности пастерелл.

    Для исследования в лабораторию направляют 2-3 трупа мелких животных, от крупных  животных – сердце с перевязанными  сосудами, части селезенки, печени, почек, экссудат из грудной полости  и трубчатую кость. При поражении  легких берут также их кусочки (5X5 см) на границе нормального и измененного  участков, миндалины, бронхиальные, средостенные и заглоточные лимфатические  узлы.

    Патологический  материал берут от павших (не позднее 3-5 ч после гибели) или убитых животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.

    Для диагностики пастереллеза у птиц в лабораторию направляют, кроме свежиих трупов, 5-6 живых птиц с явными признаками болезни. Больную птицу убивают в лаборатории и делают высевы из костного мозга, сердца, печени и селезенки.

    Взятие  и доставку материала осуществляют в соответствии с действующими Правилами  взятия патологического материала, крови, кормов, и пересылки их для  лабораторного исследования.

    В летнее время при длительной транспортировке  патологический материал консервируют 30%-ным стерильным раствором глицерина.

    Диагноз на пастереллез, вызванный P. multocida, считается установленным: 1) при выделении вирулентных пастерелл из крови или одновременно из нескольких паренхиматозных органов; 2) при выделении культуры только из легких крупного рогатого скота или свиней; 3) у овец одновременное выделение из легких, крови и паренхиматозных органов P. haemolytica служит основанием для постановки диагноза гемолитического пастереллеза.

    При постановке диагноза пастереллез необходимо дифференцировать от лихорадочных болезней септического характера, которые также сопровождаются появлением воспалительных отеков под кожей: сибирской язвы, эмфизематозного карбункула и злокачественного отека.

    Бактериологическое  исследование включает: микроскопию  мазков отпечатков из внутренних органов, окрашенных по Граму или Романовскому-Гимзе.  

    3.2 Культуральные свойства 

    Посевы из патологического материала, перечисленного в п. 1.6, делают в МПБ и на МПА или бульон и агар Хоттингера рН 7,2-7,4 с добавлением 10% нормальной сыворотки крови лошади (см. приложение пп. 1-4) или 5-10% аминопептида-2.

    Посев в пробирки с жидкими и твердыми питательными средами проводят пастеровской пипеткой. Пробирки с посевами инкубируют при 37-38 градусов в течение 20-48 часов.

    Одновременно  с посевами из каждого органа делают мазки – отпечатки, фиксируют 10-15 мин смесью равных объемов этилового  спирта и эфира, окрашивают по Леффлеру или Романовскому-Гимза и микроскопируют. В мазках из патологического материала пастереллы выглядят овоиды или короткие палочки с закругленными концами и заметной биполярностью,

    вокруг  которых может быть видна прозрачная капсула.

    В жидких питательных средах рост пастерелл сопровождается сначала слабым помутнением, затем через 24-36 часов возможно просветление среды и выпадение на дно пробирки осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички.

    На  сывороточном агаре или агаре с аминопептидом-2 пастереллы растут в виде прозрачных, средней (диаметром до 3 мм), округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета.

    На  простых питательных средах без  добавления сыворотки крови пастереллы растут не всегда удовлетворительно.

    У выделенных культур изучают культуральные, тинкториальные и морфологические свойства. В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имеют вид грамотрицательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно и попарно. 

    3.3 Биохимические свойства 

    Пастереллы  хорошо растущими на обычных питательных средах при. При пересеве свежевыделенных культур необходимо использовать среды с добавлением сыворотки крови или среды, полученные путём ферментативного гидролиза мяса. Рост бактерий в бульоне вызывает равномерное помутнение среды, на МПА образуются 3 формы колоний: гладкие (S), шероховатые (R) и мукоидные (М). Ферментативные свойства слабые. Наиболее характерным считается образование в бульоне с триптофаном индола и восстановление нитратов в интриты. Окрашивается всеми анилиновыми красками. Бактерии они хорошо окрашиваются биполярно метиленовой синькой или по Рамоновскому – Гимза.

    Суточную  агаровую культуру высеевают в среды Гисса с глюкозой,  маннитам, сахарозой, маннозой, в ПМА, молоко, желатин,  на кровяной сывороточной МПА или агар Хоттингера  в МПБ с 1% нитрата калия,  в среду с мочевиной .

    Для определения редукции нитратов исследуемые  культуры засевают в МПБ с 1% нитрата  калия и выращиванием в течение 48-72 ч. Затем в пробирку добавляют 1 куб см 2%-ного водного раствора крахмала, 1куб см 1%-ного раствора йодистого  калия и 1-2 капли 5%-ного водного раствора серной кислоты и взбалтывают. При положительной реакции среда приобретает окраску от темно-синего до коричневого цвета; при отрицательной – цвет среды желтый или слабо синий.

    Индол выявляют с помощью индикаторных бумажек или по методу Легаль-Вейла.Индикаторные бумажки готовят из полосок фильтровальной бумаги длиной 10-12 см, пропитывая их горячей щавелевой кислотой, высушивают в термостате и хранят в банке с притертой пробкой.С целью выявления индола  в пробирку с МПБ после засева культуры под ватную пробку помещают полоску индикаторной бумажки с таким расчетом, чтобы нижний ее конец не касался среды, и инкубируют при 37 градусах С 24-72 ч. При выделении индола нижняя часть бумажки приобретает розовую окраску.

    Метод Легаль-Вейла. В пробирку с суточной бульонной культурой пастерелл вносят 4-5 капель 5%-ного водного раствора нитропруссида натрия, перемешивают и добавляют вначале такой же объем 40%-ного водного раствора N2OH, а спустя 1-2 мин 4-5 капель ледяной уксусной кислоты. При наличие индола бульонная культура приобретает сине-зеленую окраску.

    Для определения уреазы в пробирку, содержащую среду с мочевиной, закапывают 2-3 капли 24-часовой изучаемой бульонной культуры. Посевы культивируют 20-24 ч. при 37 гр. С. При наличии фермента уреазы происходит  покраснение среды.

    Все виды пастерелл неподвижны, не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют с образованием кислоты без выделения глаза глюкозу, маннозу, сахарозу.

    P.agrogenes   в отличие от других видов ферментирует углеводы с выделением газа.

    На  кровяном сывороточном МПА или агаре Хоттингера  P.haemolytica образует колонии с отчетливой зоной гемолиза, которая лучше просматривается после снятия колонии со среды. Остальные виды пастерелл гемолиза не вызывает.

    Дифференциация  серовариантов Р. Изучаемую 18-часовую бульонную культуру бактериологической петлей высевают на чашку Петри со свежеприготовленным 1,5%-ным агаром Хоттингера. Посев проводят, не

    отрывая петли от поверхности агара, параллельными штрихами на расстоянии 7-10 мм один от другого. Затем бактериологической петлей одним штрихом по диаметру чашки, перпендикулярно нанесенным штрихам, высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus (культура

    должна  обладать хорошей гемолитической активностью, что определяют высевом ее на кровяной сывороточный МПА).Чашки с посевами инкубируют при 37градусов С и через 18-24 час учитывают результаты. Штаммы, образующие вблизи (до 5 мм) от линии  роста стафилококка более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, относятся к сероварианту А. Кроме  того колонии P. multocida сероварианта А, растущие вблизи стафилококка, при просмотре в проходящем свете имеют окраску в отличие от остальных флуоресцирующих колоний. Размер колоний серовариантов В и Д в данном тесте не изменяются.

    Исследуемую бульонную культуру (5-6 куб см ) центрифугируют при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспензируют в оставшейся в пробирке надосадочной жидкости до получения гомогенной суспензии. К полученной суспензии приливают 0,5 куб см водного свежеприготовленного раствора акрифлавина 1: 1000 и тщательно перемешивают.Штаммы, относящиеся к сероварианту Д, в течении 10-15 мин после добавления раствора акрифлавина образуют крупнохлопчатый  неразбивающийся при встряхивании флоккулят. Кроме штаммов P. multocida сероварианта Д, флоккулят могут образовывать диссоциированные культуры других серовариантов, но в этом случае флоккулят мелкохлопчатый и легко

    разбивается при встряхивании.

    Сероварианты  Ф и В дают отрицательную реакцию  флоккуляции. Штаммы P multocida, не обладающие указанными выше свойствами, относятся к сероварианту В. 

    3.4 Антигенное строение возбудителя 

    P. multocida в антигеном отношении неоднородна.  По результатам реакции серозащиты  различают 4 иммунологических типа  – 1, 2, 3 и 4 (Робертс, 1947), что позволяет  по капсульному антигену выделить, в РНГА 4 серологические группы пастерелла – А, В, Д, Е и 12 соматических типов (Картер, 1961). Определение антигенной структуры штаммов P. multocida играет большую роль при подборе вакцинных штаммов, в частности для приготовления вакцины против пастереллеза крупного рогатого скота — серотип В, птиц — А и D и свиней — А, В, D.

    Патогенные  и вирулентные свойства различных  серогрупп возбудителя колеблются в широких пределах. Наиболее выражены они по отношению к тому виду животных, от которых выделены. Группа Д –  встречается у всех видов животных. У пастерелл отмечается определенная зависимость между вирулентностью, капсулооброзованием и токсинообразованием (липополисахаридный эндотоксин). Эпизоотические штаммы пастерелл высоковирулентны для белых мышей. 

    3.5 Биопроба 

    Биологическое исследование проводят для определения  патогенности выделенной культуры пастерелл и при необходимости с целью обнаружения возбудителя в патологическом материале.

    Патогенность  культур определяют на белых мышах  массой 16-18 гр. С этой целью двум белым  мышам вводят подкожно по 0,2 куб см 18-24 – часовой бульонной культуры.

    Вирулентные штаммы P. multocida , относящиеся в основном к сероварианту В и являющиеся возбудителями геморрагической септицемии, вызывают гибель зараженных белых мышей в течении 24-72 час; слабовирулентные штаммы серовариантов А и Д, участвующие в развитии

    пневмоний – через более продолжительный  срок (до 7 сут.). P.haemolytica может вызвать гибель белых мышей только при внутрибрюшинном заражении. Остальные виды пастерелл, как правило, для лабораторных животных непатогенны.

    Патогенность  культур, выделенных от птиц, проверяют  на белых мышах или цыплятах. Суточную бульонную культуру вводят двум белым  мышам внутрибрюшинно по 0,2 куб см или двум цыплятам 90-120 – дневного возраста внутримышечно по 1,0 куб см.

    Для обнаружения возбудителя пастереллеза в патологическом материале суспензий из органов заражают двух белых мышей подкожно в дозе 0,2 куб см. При этом надо учитывать, что не все виды пастерелл, играющие роль в патологии сельскохозяйственных животных, вызывают гибель зараженных белых мышей.

    Культуру  считают патогенной, а биопробу положительной при гибели через 24-72 ч хотя бы одного из зараженных животных и выделении от него культуры пастерелл. Срок наблюдения за зараженными животными – 7 сут. 

    4 УСТОЙЧИВОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЯ 

    Устойчивость  пастерелл невысокая, в естественных условиях они сравнительно быстро погибают. В навозе микробы сохраняют жизнеспособность около месяца, в воде при 5-8°С до 18 дней, в труппах и в почве в зимнее время – более 4 месяцев. В помете птиц возбудители выживают от 12 до 72 дней, в замороженных тушках птиц – в течении года. Прямые солнечные лучи убивают пастерелл за несколько минут, при температуре 70 – 90 °С они гибнут за 5 – 10 мин. Все общеизвестные дезинфицирующие вещества (3%-ный раствор карболовой кислоты, 5%-ное известковое молоко) в обычных концентратах губительно действуют на возбудителя в течении нескольких минут, он чувствителен к антибиотикам (1-я группа по устойчивости).