Принципы  контроля инактивированных вакцин.

  Перед выпуском инактивированные вакцины тщательно проверяют на отсутствие вируса, особенно если их готовят из вирулентных штаммов. Если вакцина расфасована в многодозовые ампулы (флаконы), к ней добавляют фенол, мертиолат, формалин и другие консерванты для предотвращения случайного бактериального загрязнения. Несмотря на все меры, инактивированные вакцины пока, как правило, не обеспечивают такой напряженной и длительной защиты, как живые. Несмотря на это, против некоторых болезней созданы достаточно эффективные инактивированные вирусные вакцины, являющиеся на сегодня единственно приемлемыми препаратами для специфической профилактики.

  Методы  контроля инактивтрованных вакцин на авирулентность. Инактивированные вакцины в ряде случаев применяют для усиления иммунитета, созданного живыми вакцинами. Основные показатели качества инактивированных препаратов, предназначенных для профилактической вакцинации, безопасность и высокая иммуногенность.

  При оценке качества ряда инактивированных препаратов первостепенное значение приобретает контроль авирулентности, направленный на выявление оставшихся жизнеспособных вирионов. Считается, что чем опаснее возбудитель, тем надежнее должны быть условия инактивация и методы контроля ее эффективности. Степень безопасности инактивированных вакцин находится в неразрывной связи с чувствительностью тест-системы, по которой оценивается полнота инактивации вируса. В связи с этим разработка наиболее чувствительных и совершенных методов обнаружения минимальных количеств живого вируса в инактивированпых препаратах имеет важное значение. Следует иметь в виду, что, несмотря на стремление достичь полной инактивации вирусных частиц, всегда остается статистическая вероятность того, что какая-то часть из них может выдержать соответствующую обработку. Риск существования очень небольших количеств остаточного инфекционного вируса повышается по мере увеличения масштабов применения вакцины.

  Для определения полноты инактивации  вирусов в инактивированных вакцинах используют чувствительные культуры клеток, восприимчивых животных, а также  куриные эмбрионы. 

  Живые вакцины.

Живые вирусные вакцины—это, как правило, искусственно ослабленные посредством культивирования или природные авирулентные либо слабовирулентные иммуногенные штаммы вируса, которые в серийных пассажах на естественно восприимчивых животных не проявляют повышения вирулентности и потеряли способность к горизонтальной передаче.

  Вакцинные вирусные штаммы должны удовлетворять  требованиям в отношении их биологической стабильности, в частности, их приживляемости, т. е. способность их к размножению в привитом организме должна быть ограниченной. Вакцинные штаммы обладают значительно менее выраженной инвазийностью, чем их вирулентные предшественники. Это связано с их частично ограниченным репликативным потенциалом в месте проникновения или в органах-мишенях естественного хозяина. Peпликация вакцинных штаммов в организме легче подавляется естественными неспецифическими защитными механизмами. Штаммы размножаются в привитом организме до тех пор, пока его защитные механизмы не затормозят их развитие. В течение этого времени образуется такое количество антигена, которое обычно превышает дозу его, вводимую при одной инокуляции инактивированной вакцины. Однако не у всех вирусов получены аттенуированные мутанты с такими свойствами.

При изготовлении живых вакцин используют вакцинные  штаммы только в том диапазоне  пассажей, который определен для  каждого из них в предварительных опытах и является гарантией безвредности и активности вакцины.

Кроме обычного серийного культивирования, для ускорения аттенуации вирусов использовали метод быстрых пассажей, суть которого заключается в следующем. Уже на paнниx этапах аттенуации в популяции виpуca появляются новые мутанты, отличающиеся более быстрым размножением в новой системе и аттенуированным фенотипом. Если применять большую заражающую дозу и собирать «ранний» урожай вируса для очередного пассажа, то можно значительно ускорить процесс аттенуации.  

  Молекулярные основы аттенуации вирусов.

  . Аттенуация вирусов посредством длительного пассирования в клеточных культурах в настоящее время является основным методом получения живых вирусных вакцин. Этот метод основан на селекции пассажных мутантов, отличающихся биологическими свойствами от исходных вирулентных штаммов. Полученные таким образом аттенуированные иммуногенные штаммы аккумулируют в себе множество спонтанных мутаций, что затрудняет выяснение природы их аттенуации. Генетическая основа аттенуации используемых живых вирусных вакцин в большинстве случаев остается невыясненной.

Аттенуация вирусов сопровождается изменением ряда фенотипических свойств, хотя лишь некоторые из них картированы на вирусном геноме. Несмотря на разноплановость исследований и широкую вариабельность свойств изучаемых вирусов, полученные результаты можно суммировать следующим образом:

  мутации, ответственные за аттенуацию вируса, могут локализоваться в различных участках генома; чем больше мутаций, тем прочнее аттенуация;

  мутации, затрагивающие структурные белки, более существенные для аттенуации, чем затрагивающие неструктурные белки пли мутации в некодирующей области генома;

  мутации различных аттенуированных штаммов (серотипов) одного и того же вируса могут иметь различную локализацию.

  С точки зрения структурно-функционального  принципа можно выделить по крайней мере пять областей генома, мутации в которых связаны с аттенуацией вируса:

-мутации  в области гена, кодирующего белки,  определяющие взаимодействие вируса с клетками-мишенями (многие вирусы);

  -мутации  в области неструктурной лидерной  последовательности (пикорнавирусы и др.);

  -мутации  в области гена, кодирующего белки,  претерпевающие протеолитическую активацию и определяющие инфекционность (парамиксовирусы, ротавирусы);

  -мутации  в области гена, кодирующего тимидинкиназу  (герпес- и поксвирусы):

  -мутации в области гена, кодирующего потенциальный сайт гликозилирования (ортомиксовирусы).

Если исходить из практических результатов применения живых вирусных вакцин, то следует сделать два допущения, имеющих принципиально важное значение.

  Во-первых, все аттенуированные штаммы, используемые в качестве живых вакцин, должны размножаться в организме и практически не поражать клетки-мишени, повреждение которых вирулентными штаммами определяет патогенез естественной инфекции.

  Во-вторых, все аттенуированные вакцинные штаммы или вовсе не размножаются в клетках-мишенях, поражаемых вирулентными штаммами гомологичных вирусов, или их репродукция в этих клетках блокируется на разных стадиях репликативного цикла. В этом смысле ограничение любых важнейших функций вируса может привести к его аттенуации. Из этого следует, что любой экспрессируемый ген может содержать мутационные изменения.

Основным преимуществом живых вакцин считается активизация всех звеньев гуморального и клеточного иммунитета.

  Гетерологичные  вакцины

 

  В настоящее время известен ряд вирусов, которые можно использовать в качестве гетерологичных вакцин у животных. Так, вирус оспы голубей используют для иммунизации против оспы кур. Вирус фибромы Шоупа предохраняет кроликов от миксоматоза, и его длительно применяли с этой целью в практических условиях. Парвовирусный энтерит собак профилактируют вирусом панлейкопении кошек, а инфекционный гепатит собак — аденовирусом тнпа-2 собак. Пожалуй, наиболее известным и экономически важным примером использования гетеpoлoгичныx вакцин в современной ветеринарной практике является использование вакцины из вируса герпеса индеек против болезни Марека кур. Антигенно родственный возбудителю болезни Марека вирус герпеса индеек обладает природной апатогенностью и для индеек, и для кур. Его с большим успехом применяют во всем мире в качестве вакцины против этой инфекции, причиняющей очень большой экономический ущерб промышленному птицеводству. Вакцинация суточных цыплят этой вакциной дает возможность резко снизить отход

  Реассортантные вакцины

  Вирусы, имеющие сегментированный геном, могут  быть успешно аттенуированы путем  генной реассортации. Аттенуация  этих вирусов состоит в том, чтобы  заранее полученным и охарактеризованным аттенуированным штаммам придать  необходимую антигенность. От доноров аттенуации берут гены , кодирующие внутренние белки и ограничивающие репликацию, от  актуальных эпизоотических штаммов заимствуют гены, кодирующие поверхностные протективные белки ( гликопротеины).   

  В заключение следует отметить, что  наряду с выраженными достоинствами живые вакцины имеют ряд недостатков. Основной из них — риск появления вирулентности вакцинного вируса вследствие реверсии к дикому типу в процессе размножения в организме восприимчивых животных

  Другая  потенциальная опасность состоит в возможности возникновения персистентной инфекции, вызванной вакцинным штаммом.

  Кроме того, живые вакцины могут быть загрязнены посторонними вирусами, попадающими  в них вместе с биологическими субстратами, используемыми при  изготовлении вакцины.

  Стабильность живых вакцин при длительном хранении-серьезная проблема, особенно при  использовании лабильных вакцинных штаммов( болезнь Марека).

  Субъединичные вакцины

Одним из возможных путей усовершенствования противовирусных препаратов является приготовление субъединичных (компонентных) вакцин.

  Субвирусные компоненты получают разрушением вирусных частиц с тем, чтобы в вакцину  включить только те компоненты, которые  вызывают образование нейтрализующих антител. Субъединичные вакцины, как правило, готовят из поверхностных структур (капсидов, суперкапсидов и клеточных мембран), содержащих протективные антигены. Для создания подобных препаратов, прежде всего, необходимо выявить антиген или антигены вириона, выполняющие протективную функцию.

  Структурные протективные антигены идентифицированы у многих вирусов. Это белки или чаще гликопротеины, расположенные в поверхностных структурах вириона. При введении животным они вызывают выработку вируснейтрализующих антител и обеспечивают специфическую защиту.

  Следует иметь в виду, что при некоторых вирусных инфекциях (герпес-, ретровирусы и др.) протективные антигены могут быть связаны с поверхностью инфицированных клеток и быть вирусспецифическими невирионными компонентами.

  Как известно, большинство тяжелых вирусных инфекций человека и животных вызывают так называемые оболочечные вирусы, наружная липопротеиновая оболочка которых покрыта пепломерами, состоящими из гликопротеинов.

  Разработку  субъединичных вакцин начали в связи  с необходимостью повышения эффективности инактивированной вакцины против гриппа человека. Такие вакцины, содержащие поверхностные антигены вируса — гемагглютинин и нейраминидазу, менее токсичны, чем инактивированные цельновирионные вакцины, однако повышения защитного эффекта не достигнуто.

  Очищенные субъединичные вакцины против гриппа были первыми вакцинами высокой биохимической чистоты для практического применения.

  Эффективность субъединичных вакцин обусловлена  не только собственной иммуногенной активностью вирусных гликопротеинов или белков. Для усиления иммуногенной активности вирусных компонентов используют адъюванты. В настоящее время описано также значительное количество иммуностимулируюших препаратов. Среди них в разработке субъединичных вакцин используют представителей четырех основных групп:

• масляные адъюванты
• адсорбенты
• , мурамилдипептид и его производные
• иммуностимулирующие комплексы (ИСКОМ).

  Одной из главных проблем производства субъединичных вакцин является источник вирусного сырья.

  Рекомбинантные  живые вакцины

 

  Подход  к получению безопасной эффективной живой вакцины заключается в использовании стабильного вакцинного вирусного штамма для создания рекомбинантов, которые экспрессируют протективные антигены других вирусов, против которых желательно создать иммунитет. На сегодня наибольший эффект получен с вирусом осповакцины в качестве рекомбинантного вектора. Этот вирус имеет большой геном с различными участками, в которые могут быть встроены чужеродные гены без серьезного нарушения способности вируса осповакцины к репликации.

  Выбор вектора является важным моментом с различных точек зрения. Для практических целей используют ДНК-овые вирусы. Потенциальными кандидатами являются ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся в ядре или цитоплазме. Первые во многих случаях могут быть интегрированы в клеточную ДНК, что может привести к персистенции вируса и клеточной трансформации. Этот факт — хороший аргумент в пользу выбора «цитоплазматических» вирусов, таких как вирус осповакцины. Это один из самых крупных вирусов человека и животных. Его геном представлен молекулой двухцепочечной ДНК, содержащей около 187 тыс. пар оснований. Участок генома вируса осповакцины, кодирующий тимидинкиназу, не является геном, функция которого жизненно необходима для размножения вируса. Именно этот участок генома вируса осповакцины можно заменять на чужеродные ДНК.