Вирусные  вакцины

  Современной науке известны сотни видов патогенных вирусов, относящихся более чем к 20 семействам, избирательно поражающих все системы организма человека и животных. Природное многообразие вирусных болезней вызвало необходимость наряду с санитарно-гигиеническими мерами прибегнуть к специфической профилактике с использованием широкого круга вакцинных препаратов. Вакцино-профилактика занимает ведущее место в борьбе со многими вирусными заболеваниями человека и животных. Несмотря на большое разнообразие вирусов и вызываемых ими заболевания, имеются общие принципы приготовления и применения вирусных вакцин. Однако не все вирусные болезни в

  одинаковой  степени можно контролировать вакцинацией. В этой связи следует заметить, что при должном внимании к вопросам вакцинации не следует игнорировать важности изучения патогенеза болезни.

  Согласно  традиционному принципу классификации  все вакцинные препараты делят на живые и инактивированные. Первые содержат живые, как правило, аттенуированные штаммы вируса и отличаются способностью размножаться

  в привитом организме (реплицирующиеся  антигены), вторые готовят из инактивированных вирусов или их антигенных и иммуногенных компонентов (нереплицирующиеся антигены).

  Большинство применяемых в настоящее время  вакцин содержит антигены вирулентного вируса, против которого предполагаегся создать иммунитет, или антигены его вирулентных мутантов. Такие вакцины называют гомологичными.

  Используя другие принципы классификации, вакцинные  препараты можно разделить на две большие группы: цельновирионные и компонентные (субъединичные). Причем к первой группе относятся как живые, так и инактивированные вакцины. Живые гомологичные вакцины в свою очередь могут различаться способом получения и быть представленными природно аттенуированными или искусственно ослабленными штаммами, включая рекомбинатные и реассортантные, а также штаммы, аттенуированные целенаправленными генетическими манипуляциями. К компонентным (субъединичным) вакцинам можно отнести все, что не входят в рубрику цельновирионных вакцин. Прежде всего, сюда относятся вакцины, полученные из компонентов вирионов или вирусинфицированных клеток после их разрушения. Кроме них к этой категории относятся субъединичные вакцины, приготовленные из вирусных белков, экспрессируемых клонированными вирусными генами в прокариотических или эукариотических системах. Сюда же можно отнести живые рекомбинантные вакцины, которые по своей сути являются реплицирующимися субъединичными вакцинами. Клонированные гены, реплицируясь в составе вирусного вектopa, обеспечивают экспрессию белков, ответственных за индукцию специфического иммунитета.

  Вакцины на основе вирусспецифических пептидов, получаемых синтетическим путем, в известном смысле, тоже можно отнести к разряду субъединичных (эпитопных) вакцин.

  Инактивированные  вакцины

  Для профилактики вирусных заболеваний  широко применяют инактивированные вакцины, которые имеют ряд преимуществ перед живыми. Важным условием эффективности вакцин является выбор инактиватора и оптимальных условий инактивации, позволяющих полностью лишить вирус инфекционности при максимальном сохранении антигенностн. Понятие «инактивированный» относится к жизнеспособности вирусов, входящих в состав вакцины.

  Для получения безопасных вакцин применяют  физические и химические инактиваторы. Следует отметить, что инактивация должна быть не только эффективной, но и максимально щадящей (селективной). Иными словами, сопутствующие изменения в структуре вирусных частиц и их компонентов должны быть минимальными. Однако механизм инактивирующих воздействий во многих отношениях недостаточно выяснен и их использование зачастую эмпирическое.

  Физические  методы.

    Наиболее распространенными физическими  методами инактивации вирусов являются гамма- и ультрафиолетовые (УФ) лучи.

  Гамма-лучи — вид ионизирующего излучения, обладающий большой проникающей способностью. Известно, что в основе действия их лежат два эффекта: прямое и непрямое воздействие. Первое заключается в непосредственном поглощении энергии излучения биологическими молекулами. Наиболее уязвимыми мишенями являются пуриновые и пиримидиновые основания. Непрямое действие — влияние на объект автивных свободных радикалов Н, ОН, ОН₂ и молекулярных продуктов, например, перекиси водорода, образующихся в среде вследствие радиолиза воды. Перенос энергии радикалов в растворе осуществляется путем диффузии. Действие радикалов может вызвать такие изменения в ДНК, как дезaминирование оснований, дегидроксилирование, разрыв связей между дезоксирибозой и основанием, разрывы нуклеотидных цепей, окисление дезоксирибозы. В результате реакций, происходящих под влиянием прямого и непрямого действия излучения, возможны различные повреждения структуры нуклеиновых кислот вирусов: разрыв водородных связей, появление сшивок, двухцепочечных разрывов. Белковая оболочка под воздействием радиации повреждается незначительно.

  Эффективность УФ-лучей определяется их проницаемостью и адсорбцией биологическими молекулами. Белки поглощают УФ-лучи в меньшей степени, чем нуклеиновые кислоты и поэтому более устойчивы к их действию. При изучении влияния спектра УФ-лучей на инфекционность вируса простого герпеса было установлено, что наибольший инактивирующий эффект наблюдался при длине волны 260— 280 им. Эти результаты дали основание предполагать, что основным поглощающим компонентом является ДНК и именно ее повреждения приводят к инактивации вируса герпеса. Полагают, что под влиянием ультрафиолетового облучения происходит изменения структуры нуклеиновых кислот, заключающегося в образовании димеров между соседними пиримидиновыми основаниями, а также ковалентных связей между нуклеиновой кислотой и белковой оболочкой.

  Bызывая  глубокие изменения в струтуре  нуклеиновых кислот вирусов, УФ-лучи  не оказывают cущественного влияния  на белковую оболочку, вследствие  этого инактивированные вирусы  способны сохранять свою антигенную и иммуногенную активность.

  Инактивация температурой.

Исследования  по термоинактивации вирусов свидетельствуют  о сложности этого явления. По мнению большинства исследователей, инактивация вирусов под влиянием температурного воздействия определяется двумя механизмами. Термальная денатурация вирусного капсида, вероятно, заключается в частичном разворачивании белковых субъединиц и нарушении гидрофобных взаимодействий.

  К простым и доступным методам  инактивацни вирусов относится  фотодинамическое воздействие некоторых красителей, таких как метиленовая синька, акридиновый оранжевый, толуидин синий, нейтральный красный и другие, к которым чувствительно большинство вирусов. Механизм этого явления полностью не изучен. Полагают, что фотодинамическая инактивация вирусов связана главным образом с повреждением нуклеиновой кислоты, хотя изменению подвергаются и их белковые компоненты.

  Химические  методы. Из химических соединений, наиболее часто применяемых для инактивации вирусов, можно выделить формальдегид и бетапропиолактон. Первый инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.

  Механизм  инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает соответственно по типу реакции первого и второго порядков. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.

  Взаимодействуя  с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.

  Формальдегид  с большей скоростью взаимодействует  с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метинольных производныx, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид peaгирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или аминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метинольные производные, а затем в результате вторичных реакций — бизметиленовые производные.

  Продукты  взаимодействия формальдегида с  аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид.

  Во  второй стадии происходит медленное  взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов.

    Бета-пропиолактон- представляет собой высокоактивный алкилирующий агент, не стоек в водных растворах и легко гидролизуемый с образованием безвредных веществ: гидроакриловой и бета-оксипропионовой кислот. Инактивация вирусов бета-пропиолактоном зависит от концентрации инактиватора, температуры взаимодействия и содержания белка в вирусной суспензии. Повышение концентрации бета-пропиолактона может привести к нежелательной реакции с вирусными белками и вследствие этого к снижению антигенной активности. Имеются сведения о комбинированном использовании бета-пропиолактона и ультрафиолетового облучения при инактивации некоторых вирусов.

  Из  других химических веществ для инактивации вирусов представляет интерес гидроксиламин, который как и бета-пропиолактон полностью разлагается в течение короткого периода. Инактивирующее действие гидроксиламина определяется его взаимодействием с пиримидиновыми основаниями нуклеиновой кислоты, зависящим от величины рН. В слабокислой среде происходит главным образом изменение цитозина, а в щелочной — урацила. Обработка некоторых вирусов (полиомиелита, бешенства, западного и восточного энцефаломиелита лошадей, гриппа, ньюкаслской болезни, осповакцины и др.) гидроксиламином при оптимальном режиме инактивации не приводила к существенным изменениям их антигенной активности, что позволило использовать это вещество для изготовления диагностических антигенов и инактивированных вакцин.

В последний  годы внимание исследователей привлекли  азиридины и особенно этиленимин и его производные. Этиленимин — насыщенное гетероциклическое соединение, впервые было синтезировано из бромэтиламина в 1988 г. Этиленимин, как и другие азиридины, относится к группе высокореакционных алкилирующих соединений, обладающих токсичностью.

  Этиленимин  и его производные оказывают  сильное инактивирующее действие на вирусы, сохраняя их антигенные свойства. Инактивирующий эффект этиленимина на вирусы, по-видимому, объясняется депуринизацией и последующей деполимеризацией нуклеиновых кислот. Замена формальдегида этиленимином основывалась на следующих преимуществах. В отличие от формальдегида, вызывающего образование поперечных связей в вирусных белках, этиленимин оказывал влияние только на нуклеиновую кислоту. При 25 °С инактивация вируса представляла собой быстрый, легко контролируемый линейный процесс. Для инактивации вирусов чаще применяют ацетилэтиленимин (АЭИ). Обширные исследования по использованию азиридинов для приготовления инактивированных противовирусных вакцин во многом обязаны исследованиям с вирусом ящура.

  Анализируя  приведенные данные, следует отметить, что из наиболее часто применяемых инактивирующих воздействий можно выделить химические (обработка формальдегидом или бета-пропиолактоном) и физические (облучение) воздействия.

  Облучение (например, УФ-светом), при котором  мишенью является геномная нуклеиновая кислота, имеет несомненное преимущество, поскольку исключаются эффекты «последствия». Этот прием довольно часто применяют для получения инактивированных вакцинных препаратов. Недостатки его — необходимость использования довольно сложной аппаратуры и нередкие повреждения антигенной структуры вирусныx белков при недостаточной надежности инактивации. Кроме того, повреждение нуклеиновой кислоты и ряде случаев оказывается нежелательным.

  Химическая  инактивация вирионов технически более  проста. Однако надежное подавление инфекционности нередко сопровождается существенным снижением других видов биологической активности, в том числе иммуногенности. К тому же, в ряде случаев требуется удаление (нейтрализация) инактиваторов.

  Таким образом, инактивация вирусов физическими  и химическими факторами сопровождается разнообразными изменениями вирусных компонентов. Можно сказать, что все инактивирующие агенты в той или иной степени вызывают изменения как в нуклеиновой кислоте, так и в белковой оболочке. При этом характер изменений вирусных частиц во многом определяется природой инактивирующего агента и возбудителя.

  Из всех физических методов инактивации вирусов ионизирующее излучение оказалось наиболее перспективным. По сравнению с обычными формолвакцинами, радиовакцины имеют более высокую иммуногенность и дольше сохраняются. Однако в каждом случае необходимо находить оптимальную дозу облучения, которая в данных условиях надежно инактивирует вирус, не снижая при этом его антигенных свойств. Необходима большая предварительная работа, чтобы с учетом конкретного возбудителя, состава культуральной среды и инактивирующего вещества найти оптимальные режимы инактивации.

  Хотя  с помощью описанных методов  можно приготовить вакцины почти  из всех вирусов, они могут сильно отличаться по иммуногенности. Причина такого разнообразия пока недостаточно ясна. В одних случаях это может быть следствием повреждающего и денатурирующего воздействия инактивирующих агентов на вирусные антигены, в других — слабой антигенности вируса, когда даже естественное переболевание не сопровождается образованием выраженного иммунитета. Иногда это может обусловливаться абсолютным сходством поверхностных вирусных антигенов с антигенами организма-хозяина, в связи с чем они не могут вызывать интенсивного иммунного ответа (например, при африканской чуме свиней).