Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Вирус инфекционного гепатита собак

После проникновения  вируса в центральную нервную  систему возникает нарушение  ее регуляторной функции, сопровождающейся локомоторными расстройствами. В период выраженных клинических признаков вирус находится в крови, во всех секретах и экскретах, позднее - только в почках и моче. Симптомы. При естественном заражении собак вирусом инфекционного гепатита инкубационный период продолжается от 3 до 9 дней, при экспериментальном заражении - 2-6 дней. Часто наблюдается острое течение гепатита. У больной собаки отмечаются угнетенное состояние, вялость, отказ от корма, усиленная жажда, рвота с примесью желчи, односторонние или двусторонние кератиты (рис. 64) и тонзиллиты. Больная собака менее подвижна, больше лежит, с трудом встает, при движении походка у нее шаткая. Одновременно повышается температура тела, развиваются ринит, понос, желтушность слизистых оболочек. При надавливании на область печени устанавливают болезненность. Нередко появляются судороги и параличи конечностей.

С повышением температуры  тела начинаются расстройства со стороны  сердечно-сосудистой системы. Число  сердечных ударов возрастает до 90-110 и выше в минуту. По качеству сердечный  толчок усиливается, а пульс при тяжелом течении болезни ослабляется, иногда аритмичен. Дыхание учащается до 40-50 в минуту. При прослушивании легких слышны хрипы.

При исследовании крови выявляют в начале болезни  резко выраженную лейкопению -2-3 тыс. лейкоцитов, затем лейкоцитоз - до 30-35 тыс. Лейкоцитарная формула во время инфекционного процесса претерпевает почти всегда закономерные изменения. В первые дни наблюдают относительное увеличение процента нейтрофилов с исчезновением эозинофилов и сдвигом влево до юных, снижение процента лимфоцитов до 7-15, моноцитоз. Отмечается токсическая зернистость нейтрофилов, у многих животных в крови появляются плазматические клетки. В острый период болезни значительно ускоряется РОЭ - до 20-30, реже до 60 мм/ч и достигает 70-80 мм в течение 24 ч.

Подобные изменения картины крови отражают состояние организма животного в ходе его борьбы с инфекцией. Уменьшение количества лейкоцитов и эозинофилов, а также резко выраженный сдвиг влево - неблагоприятные показатели, свидетельствующие о злокачественном течении болезни. И наоборот, резкое увеличение числа лейкоцитов и восстановление нормального числа эозинофилов свидетельствует о выздоровлении животного.

Продолжительность болезни у собак различная - от нескольких дней до 2-3 недель. Погибают они обычно, находясь в глубоком коматозном состоянии, совершенно не реагируя на внешние раздражения.

При хроническом  течении гепатита у собак симптомы болезни выражены нерезко и носят  неопределенный характер. Наиболее часто  регистрируют исхудание животного, ремитирующую лихорадку, анемию слизистых оболочек, явления гастроэнтерита, отечность подкожной клетчатки. Хронически больные самки чаще всего абортируют или приносят нежизнеспособных щенят. Отмечаются также долго непроходящие кератиты одного или обоих глаз.

Латентная форма болезни сопровождается выделением вируса без признаков заболевания, однако болезнь может возникнуть под влиянием неблагоприятных факторов, снижающих резистентность организма.

Патологоанатомические изменения в органах и тканях при инфекционном гепатите собак чрезвычайно разнообразны и зависят от продолжительности и тяжести инфекционного процесса.

При наружном осмотре  павшей собаки отмечают анемию слизистых  оболочек, желтушное окрашивание  и гиперемию конъюнктивы. На анемичных  оболочках, особенно на деснах, встречаются точечные кровоизлияния. Миндалины часто гиперемированы, отечны. Изменения в других органах (кроме печени) не являются строго специфичными, общими бывают кровоизлияния различной локализации.

Наиболее характерные  изменения устанавливают в печени. Она увеличена в объеме, имеет коричневатый или темно-красный цвет и фибринозный налет на поверхности. Стенки желчного пузыря отечны. Более чем в 40% случаев в брюшной полости встречается прозрачный желтоватый или кровянистый экссудат, имеющий вид чистой крови.

Селезенка набухшая, вишнево-красного цвета, кровенаполнена, пульпа на разрезе сочная, соскоб обильный. Иногда она бывает не увеличена, красновато-серого или серовато-малинового цвета. Иногда по краям располагаются очажки инфаркта. В желудке обычно имеется только слизь темно-коричневого или почти черного цвета. На слизистой оболочке желудка возможны геморрагии, иногда эрозии. В кишечнике чаще наблюдают незначительные изменения, но иногда слизистая оболочка тонкого и толстого отделов утолщена, покрыта большим количеством слизи и множественными кровоизлияниями.

Постоянные  признаки инфекционного гепатита - студенистый отек и полнокровие  вилочковой железы, в большинстве  случаев с множественными кровоизлияниями  в ней. Вокруг вилочковой железы прилегающие  ткани сильно отечны и могут распространяться на шею, нижнюю поверхность груди и средостение.

Почки большей  частью увеличены, капсула напряжена. но снимается легко. Паренхима пронизана  точечными и полосчатыми кровоизлияниями. На разрезе рисунок сглажен, граница между корковым и мозговым слоями сглажена. Часто почки бывают застойно гиперемированы, а мозговой слой их темно-красный.

Поджелудочная железа увеличена, кровенаполнена, серовато-желтого  цвета. На поверхности точечные кровоизлияния, часто проникающие в глубь ткани.

Степень изменения  других органов зависит от длительности болезни. Так, в сердечно-сосудистой системе наблюдают серозный перикардит, в легких - уплотнения и отдельные  участки ателектаза, в головном мозге  в отдельных случаях может  быть заметная гиперемия, изредка точечные кровоизлияния в области подкорковых узлов и нижележащих отделов ствола.

При длительном течении болезни патологические изменения сводятся к сильной  или умеренно выраженной дистрофии. При тяжелых изменениях ткань  печени малокровна, наряду с очаговыми некрозами бывают обширные некрозы с гибелью значительных участков паренхимы. Характер дегенеративных изменений складывается из паренхиматозного, зернисто-жирового перерождения, нередко с явлениями клеточного распада. Распространенность и интенсивность изменений бывают неодинаковы не только у различных больных собак, но и у одного и того же животного в различных участках органа.

В селезенке  и лимфатических узлах наблюдают  полнокровие и ретикулярную гиперплазию  пульпы. Часто отмечают некробиотические изменения в центре фолликулов.

В почках можно  видеть полнокровие клубочков, набухание  клеток эндотелия капилляров клубочков. В почечных канальцах заметны  дистрофические изменения эндотелия, который в большинстве случаев  набухший, границы между клетками сглажены.

В головном мозге  отмечают инъекцию сосудов мягкой мозговой оболочки, в некоторых случаях - диапедезные  кровоизлияния. Иногда можно наблюдать  круглоклеточную инфильтрацию мягкой мозговой оболочки, в нервных клетках - тяжелые дистрофические процессы, часто заканчивающиеся лизисом нейронов.

При гистологическом  исследовании наиболее выраженные и  постоянные изменения обнаруживают в печени, особенно в центральной  части долек. Синусоидные капилляры  расширены кровью, в которой много  молодых эритроцитов. Одновременно отмечают серозный выпот в пространстве Диссе. Сами печеночные клетки в состоянии зернистой дистрофии и некробиоза.

Диагноз на инфекционный гепатит ставят на основании анализа  эпизоотологических данных, клинических  признаков, пато-логоанатомических изменений и лабораторных исследований на наличие телец Рубарта. С целью обнаружения телец Рубарта готовят мазки-отпечатки или гистологические срезы печени.

Отпечатки и  гистологические срезы просматривают  под иммерсионной системой микроскопа. В мазках-отпечатках и гистологических срезах обнаруживают внутриядерные включения типа Рубарта, которые представляют собой гомогенную массу круглой или овальной формы, расположенную в центре ядра, с зоной просветления вокруг них. Хроматин и ядрышки располагаются по периферии оболочки ядра в виде точечных скоплений, окрашенных в темно-синий цвет. Внутри ядерные включения окрашиваются в синевато-красноватый или розовый цвет, четко контрастируя на общем фоне препарата.

В настоящее  время для лабораторной диагностики гепатита с положительными результатами апробированы различные серологические и биологические методы. Среди них широкое применение нашла реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП). С экспериментальной целью используют РСК (реакцию связывания комплемента), РГА (реакцию гемагглютинации), РЗГА (реакцию задержки гемагглютинации), РИФ (реакцию иммунной флуоресценции), РН (реакцию нейтрализации), биопробу заражения щенков в переднюю камеру глаза и выделение вируса в культуре клеток.

Инфекционный гепатит собак необходимо дифференцировать от чумы, лептоспироза, сальмонеллеза, парвовирусного энтерита собак. Решающее значение при этом придают лабораторным методам исследования.

1. Реакция преципитации в геле

Для диагностики  инфекционного гепатита широко используют реакцию преципитации в агаровом геле. Простота постановки реакции, ее высокая чувствительность и строгая специфичность позволяют поста-вить диагноз в течение 24-48 ч, а также установить антигенное родство различных штаммов.

Реакция может  быть применена для лабораторной диагностики в случаях остропротекающего заболевания, поскольку преципитирующий антиген обнаруживается у больных животных на 2-3-й день после заражения в различных органах и тканях, а также для выявления перенесенного ранее процесса, так как антитела у переболевших собак могут сохраняться несколько лет.

Для постановки реакции преципитации требуются  следующие компоненты: тестирующая  система, состоящая из антигена вируса инфекционного гепатита собак, специфической  гипериммунной сыворотки против вирусного гепатита, контрольного положительного антигена, контрольного отрицательного антигена.

Механизм реакции  в геле заключается в следующем: находящиеся раздельно в геле антигены и антитела диффундируют друг к другу, и на месте их соприкосновения (встречи) образуется полоска преципитата, что указывает на положительный результат.

В качестве испытуемого  антигена используют 10%-ную суспензию  печени больных животных. Специфическую  гипериммунную сыворотку получают путем иммунизации собак или используют иммунную сыворотку реконвалесцентов. Реакция проходит при температуре 37°С в течение 48-72 ч. Сыворотку в лунки агара добавляют дробно, через каждые 12 ч.

Реакция считается  положительной, если между испытуемым антигеном и гипериммунной сывороткой в агаре появляется полоска молочного цвета, по интенсивности выявления равная заведомо известному антигену и гипериммунной контрольной сыворотке. Между нормальной сывороткой и антигеном полосок не должно быть.

Нечетко выраженные (расплывчатые) полоски преципитата расцениваются как сомнительная реакция, а образование зон вокруг лунок является неспецифической реакцией.

2. Иммунолюминесценция

Этим методом, применяя непрямой метод люминесцирующих  антител, можно выявить специфический  антиген в срезах, мазках, отпечатках, в зараженной культуре ткани. С этой целью на фиксированный в охлажденном до 20°С ацетоне препарат наносят специфическую антисыворотку собаки либо гипериммунную сыворотку лошади в пяти разведениях от 1:10 до 1:160 и выдерживают во влажной камере при 20°С в течение 20 мин, далее дважды по 10 мин промывают физиологическим раствором и просушивают. При положительной люминесценции в зоне ядра видны светящиеся глыбки антигена в первые 24-48 ч. С развитием внутриядерных включений наблюдают флюоресцирующее свечение антигенных комплексов. Интенсивность свечения оценивается по четырехкрестовой системе. Специфическое изумрудно-зеленое свечение обычно отчетливо контрастирует на фоне слабой флюоресценции цитоплазмы клеток. Флюоресцирующие гранулы обычно концентрируются в крупные гранулярные образования, которые в дальнейшем можно видеть как однородную флюоресцирующую массу. Чаще всего флюоресцирующая масса концентрируется в центре ядра, отделяясь от ядерной оболочки нефлюоресцирующим ободком.

Широко в  лабораторно-диагностической работе при диагностике инфекционного гепатита собак применяется метод неспецифической флюоресценции. С этой целью на нативный препарат под покровное стекло наносят каплю акридина оранжевого. Препарат немедленно просматривают. Внутри-ядерные включения окрашиваются на фоне зелено-желтых ядер и оранжево-красной протоплазмы.

3. Взаимоотношения с системой иммунитета

Действия вируса как инфекционного агента вызывают адекватную реакцию со стороны иммунной системы. Установлено, что через 5-7 дней после заражения начинают появляться антитела, специфичные для данного вируса. Интересно, что не все они способны обезвреживать этот вирус. Наиболее активны в вируснейтрализующсм отношении антитела к белку основания пептона и белку фибрилл. Так как именно эти структуры ответственны за проникновение вируса в клетку, то считается, что специфические антитела, присоединяясь к этим белкам, нарушают их функции. Более того, поскольку сборка капсида как бы "замыкается" на белках основания пентона, то их конформациониые изменения, которые происходят при взаимодействии с антителами, не позволяют завершать сборку вириона. В результате репродукция вируса блокируется. Особенно противовирусное действие антител усиливается в присутствии белков комплемента.

Таким образом, антитела подавляют (ингибируют) действие вирусов, находящихся в кровотоке или на стадии сборки капсида. Вместе с тем, с появлением антител начинают формироваться и иммунные комплексы (вирус-антитело), которые при избытке вируса инициируют реакции агрегации тромбоцитов и лейкоцитов на эндотелии кровеносных сосудов. А это, в свою очередь, усиливает проницаемость сосудов, что влечет за собой развитие геморрагических инфильтраций и других патологических механизмов, ухе описанных выше.

Обезвреживание  иммунных комплексов в организме обеспечивают в основном фагоциты. Они хе, вместе с эффекторными лимфоидными клетками ответственны и за процессы киллинга (убийства) пораженных вирусом клеток (фабрик вируса).

Однако здесь  отмечают, что вирус способен каким-то образом нарушать механизмы представления антигена макрофагами. В результате подавляются реакции нормального формирования специфического иммунного ответа.

Больше того, сами фагоциты и лимфоциты служат мишенью для вируса. Размножаясь  в клетках иммунной системы, вирус способен не только подавлять их функциональную активность, но и полностью разрушать фагоциты и лимфоциты. Не случайно поэтому при болезни отмечают резко выраженную лейкопению (до 2-3 тыс лейкоцитов). Организм отвечает на это усилением миграции и дифференциации стволовых клеток. И в периоды понижения температуры или выздоровления ухе можно наблюдать значительный лейкоцитоз (т.е. количество лимфоцитов и фагоцитов возрастает до 30-35 тыс.).