Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Вирус инфекционного гепатита собак

 

4. Заражение в амниотическую полость;

 

Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы.

Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцом, которая проходит через хорион-аллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

 

5. Заражение в желточный мешок.

 

С этой целью используют эмбрионы 5 – 10-дневного возраста. Наиболее употребительны для метода заражения. По первому материал вводится через  воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорион-аллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

Наблюдение  и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления характерных поражений на хорион-аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.

Рис. 1. Схематическое изображение развивающегося куриного эмбриона.

Вследствие  этого способы заражения куриного эмбриона приведены схематично на рис. 2.

Рис. 2. 1 - в амнион; 2 - в аллантоисную полость; 3 - в желточный мешок.

 

4. Индикация вируса в курином эмбрионе

1.     Гибель куриного эмбриона в характерные для данного вируса сроки. Гибель эмбрионов в первые сутки не специфична. Эмбрионы погибшие в более поздние сроки переносятся в холодильник (+ 4С). Все эмбрионы извлекают из термостата в момент максимального накопления вируса. Срок для каждого вируса - справочные данные.

2.     Вскрытие эмбриона и анализ патологоанатомических изменений.

• Отечная ХАО и белые узелки некроза (оспины).
• Мутность или изменение цвета аллантоисной и амниотической жидкостей. Красноватый цвет жидкостей - результат гемолиза.
• Изменения зародыша: карликовость, кровоизлияния, мумификация.
• Органы зародыша - некроз, кровоизлияния.

3.     Наличие гемаглютинации при проведении капельной реакции ГА. (аллантоисная жидкость + 5% р-р эритроцитов кур)

5. Недостатки метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах:

• куриные эмбрионы могут быть носителями микроорганизмов (сальмонеллы, туберкулезная палочка), в том числе вирусов (лейкоз птиц, бронхит кур и др.) и противовирусных антител.

• не все вирусы культивируются в куриных эмбрионах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА II. Частная вирусология

ЧАСТЬ 1. Вирус инфекционного гепатита собак

1. Введение

Инфекционный гепатит - контагиозное вирусное заболевание, поражающее значительную группу плотоядных. Заболевание впервые зафиксировано в Швеции Рубортом (Rubort) в 1937 году. В литературе прежних лет эту болезнь часто называли болезнью Руборта. Позднее заболевание собак инфекционным гепатитом было отмечено в Америке, Австрии, Финляндии, Германии, Швейцарии и других странах. С 1953 года болезнь регистрируют и в России. 

2. Возбудитель болезни

Возбудитель инфекционного  гепатита (он же возбудитель эпизоотического  энцефалита лисиц) - ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству аденовирусов (впервые вирусы этого семейства были выделены из аденоидов у человека).

Семейство Adenoviridac имеет два основных рода: Mastadcnovirus и Aviadenovirus. Возбудитель инфекционного  гепатита Adcnovirus canine тип 1 (Ad can-1) относится к роду Mastadcnovirus. Сюда же относится и другой аденовирус собак Adcnovirus canine тип 2 -возбудитель инфекционного ларинготрахеита у собак. При этом вид Ad can-2 в антигенном отношении имеет очень мало общего с видом Ad can-1.

Рис. 3. Схематическое строение аденовируса

1. фибрилла; 2. Пентон; 3. Гексон; 4. ДНК вируса.

Возбудитель инфекционного  гепатита собак, как и другие адсновирусы, имеет интересное и сложное строение (рис. 7). Этот вирус представлен в  форме икосаэдра (20 поверхностей и 12 вершин) диаметром 70-80 нм. Белковая оболочка (капсид) состоит из большого количества субъединиц (252), из которых 12 расположены на вершинах и называются пентонами. Остальные капсомсры называют гексонами. От каждого пентона отходит нитевидное образование - фибрилла. Получается, что структурно каждый такой пентон окружен 5 гексонами (поэтому он и называется пептоном), а гексон - 6 соединенными гексонами соответственно. Гексоны и пентоны содержат различные вирусные белки - антигены, причем если с гексонами связывают общегрупповые антигены, то в структурах пентонов расположены антигены определяющие более конкретный серовариант. Внутри капсида находится довольно крупный геном (молекулярная масса вирусной ДНК-23,8х106).

Ad can-1 обладает онкогенной активностью, вызывая образование злокачественных опухолей у лабораторных животных.

Вирус относительно устойчив к факторам внешней среды. Вирус хорошо переносит высушивание и замораживание. При комнатной температуре он сохраняет активность 10-13 недель, при 4°С — более 9 месяцев, при 37°С — до 29 дней, 50°С — 150 мин, 60°С — 3-5 мин, 100°С — 1 мин, однако вирус не термоустойчив и при кипячении погибает практически моментально. В патологическом материале, консервированном 50%-м раствором глицерина, вирус при 4°С не погибает до 8 лет. Неустойчив он также и к многим дезинфицирующим веществам (формалин, фенол, лизол, свежегашеная известь, щелочи), разрушают вирус, но устойчив к эфиру, хлороформу и метанолу. Под воздействием ультрафиолетовых лучей он быстрее всего инактивируется в водных растворах (за 30-60 мин). В испражнениях и различных биологических секретах может сохраняться в природных условиях в течение нескольких месяцев. Кроме характерного заболевания у собак и эпизоотического энцефалита у лисиц, вирус вызывает похожие заболевания у валков, медведей, койотов, песцов и енотов. Заболевание людей вирусом Ad can-1 не зарегистрировано.

3. Эпизоотологические данные

В естественных условиях к инфекционному гепатиту восприимчивы собаки всех возрастов и пород, но особенно молодняк в 1,5-6 месяцев. Животные старше 3 лет заболевают редко. Болеют также песцы, лисицы, волки и шакалы. Мыши, обезьяны некоторых видов и человек могут быть скрытыми носителями вируса инфекционного гепатита плотоядных.

Основным источником возбудителя инфекции служат собаки (реконвалесценты и вирусоносители), у которых вирус выделяется с мочой, носовой слизью, конъюнктивальным секретом и калом. Характерная эпизоотологическая особенность инфекционного гепатита собак - длительное вирусоносительство на протяжении нескольких лет.

Резервуаром вируса в природе являются дикие звери  и бродячие собаки. Заражение происходит алиментарным и контактным путем. Установлены  случаи распространения болезни  при несоблюдении правил асептики и  антисептики, при хирургических операциях, массовых прививках и др.

Имеются данные о том, что самки-вирусоносители в течение ряда лет могут заражать своих щенков, а также самцов-производителей при условии тесного контакта с ними, особенно во время случки.

При возникновении болезни в собаководческих питомниках в течение эпизоотии инфекционного гепатита наблюдается определенная последовательность. В начальном периоде развития эпизоотического процесса отмечают единичные случаи остро-протекающей болезни. В дальнейшем при отсутствии необходимых ветеринарно-санитарных мер эпизоотия распространяется более широко, захватывая в первые 2-3 недели значительное количество собак и постепенно затухая к концу 2-3-го месяца. Такая динамика развития эпизоотического процесса не бывает строго постоянной и зависит от эпизоотической обстановки и степени первичного охвата поголовья.

Заболеваемость  и летальность зависят от способствующих и благоприятствующих заболеванию  факторов. Переохлаждение, перегревание и неполноценное кормление животных, а также секундарные инфекции, различные гельминтозы и другие неблагоприятные воздействия активизируют латентное течение гепатита, обусловливая клиническое проявление болезни. Летальность при инфекционном гепатите среди собак достигает 20%. Часто гепатит сопровождается другими инфекционными заболеваниями - сальмонеллезом, чумой, колибактериозом, что ведет к резкому увеличению гибели животных и затрудняет дифференциальную диагностику.

Инфекционный  гепатит собак чаще наблюдается  весной и летом при рождении молодняка, а также ослабленные и пораженные гельминтами животные. Спорадические же случаи заболевания встречаются в любое время года и связаны в основном с обострением латентного или хронического течения болезни под влиянием каких-либо неблагоприятных факторов.

У переболевших гепатитом собак, независимо от тяжести  перенесенного инфекционного процесса, наступает продолжительный, практически пожизненный иммунитет. Антитела против вируса формируются на 15-21-й день после заражения и достигают максимума на 30-й день.

4. Симптомы

При естественном заражении инкубационный период продолжается от 3 до 9 дней, иногда дольше; при экспериментальном заражении - 6-8 дней.

Болезнь обычно начинается с постепенно нарастающей  вялости: собаки становятся малоподвижными, больше лежат, с трудом встают, при движении походка шаткая, снижается аппетит, а затем они отказываются от корма. Появляются характерные признаки гепатита: рвота с примесью желчи, односторонние или двусторонние кератиты и тонзиллит.

В дальнейшем животные быстро худеют, у них развивается анемия слизистых оболочек глаз и ротовой полости, у некоторых - желтушность склеры. Моча принимает темно-бурую окраску, что также часто является характерным признаком гепатита. Животные болезненно реагируют на пальпацию в области печени, становятся как бы осторожными в движениях. При этом часто принимают позу сидячей собаки, широко расставив передние лапы.

Особого внимания при гепатите заслуживает температурная  реакция. В первые дни болезни  температура обычно нормальная, но на 4-6-й день она быстро повышается до 41-41,7°С и держится на таком уровне почти до гибели животного. В период лихорадки носовое зеркальце у собак сухое и они испытывают повышенную жажду. Отмечается расстройство сердечно-сосудистой системы: число сердечных ударов возрастает до 90-110 в минуту и выше, сердечный толчок усилен, а пульс при тяжелом течении болезни ослаблен, иногда аритмичный. Дыхание учащено до 40-50 в минуту. При прослушивании легких слышны хрипы.

Резко выражена лейкопения (3-2 тыс. лейкоцитов), сменяющаяся в период понижения температуры значительным лейкоцитозом (до 30-35 тыс.). Лейкоцитарная формула почти всегда претерпевает закономерные изменения. В первые дни наблюдается относительное увеличение процента нейтрофилов с исчезновением эозинофилов и сдвигом влево до юных, снижение процента лимфоцитов до 7-15, моноцитоз. Отмечается токсическая зернистость нейтрофилов, у многих животных в крови появляются плазматические клетки. В острый период болезни значительно ускоряется СОЭ - до 20-30 мм, реже до 60 и достигает 70- 80 мм в течение 24 ч.

Подобные изменения  картины крови отражают состояние  организма животного в ходе его  борьбы с инфекцией. Уменьшение количества лейкоцитов и эозинофилов, а также  резко выраженный сдвиг влево - неблагоприятные  показатели, свидетельствующие о злокачественном течении болезни. И наоборот, резкое увеличение числа лейкоцитов и появление нормального числа эозинофилов свидетельствуют о выздоровлении животного.

Продолжительность болезни различна - от нескольких дней до 2-3 недель. Погибают собаки, находясь обычно в глубоком коматозном состоянии и совершенно не реагируя на внешние раздражения. Иногда за несколько часов перед смертью у некоторых животных наблюдаются подергивание отдельных групп мышц, судороги и непроизвольные движения конечностей.

При хроническом  течении гепатита у собак симптомы болезни выражены нерезко и носят неопределенный характер. Иногда они проявляются снижением или временной потерей аппетита, расстройствами деятельности желудочно-кишечного тракта (поносы, сменяющиеся запорами) и прогрессирующим исхуданием. Хроническому течению болезни свойственны редкие кратковременные подъемы температуры тела. Приступы могут быть различны как по интенсивности, так и по продолжительности обострения. Иногда наблюдается тяжелое течение болезни. Ремиссии между приступами лихорадки не имеют особой закономерности, температура повышается с интервалом в несколько дней, недель и даже в месяц. Чаще всего приступы лихорадки сопровождаются отклонениями со стороны сердечно-сосудистой системы, различной степени анемий слизистых оболочек, явлением гастроэнтерита.

Хронически  больные самки чаще всего абортируют или приносят нежизнеспособных щенят. У хроников отмечают долго не проходящие кератиты одного или обоих глаз.

5. Патогенез

Вирус, попав в организм, вначале размножается в регионарных лимфатических узлах, затем появляется в крови. Через 2-3 суток он образует скопление в виде внутриядерных включений в клетках эндотелия капилляров и венул всех органов, особенно печени и селезенки. В результате нарушения центральной части долек печени развиваются дистрофические изменения в паренхиме органа, что ведет к глубокому нарушению обмена веществ и интоксикации организма. Нарастающая интоксикация приводит к дистрофическим изменениям в почках, в сердечной мышце и множественным кровоизлияниям в слизистых и серозных оболочках, а также в паренхиматозных органах.