Производство лимонной кислоты

ВВЕДЕНИЕ 

Лимонная кислота  является основным подкислителем. Ее доля составляет около 75% объема всех производимых подкислителей. Особенно широко она используется в производстве безалкогольных напитков, которым придает фруктовые и ягодные запахи и вкус.

Расширяется сфера применения лимонной кислоты в технических целях — в химической, текстильной, кожевенной, металлургической и других отраслях промышленности. Спрос на лимонную кислоту непрерывно растет, но в бывших социалистических странах он удовлетворяется крайне слабо, поэтому в настоящее время организуются новые производственные мощности по выпуску этого ценного продукта.

Лимонную кислоту  производят главным образом путем  микробного синтеза, который является важной отраслью биотехнологии. Настоящий отчет посвящен микроорганизмам—продуцентам лимонной кислоты и современным достижениям биотехнологии в области биосинтеза органических кислот. Описаны теоретические основы микробного синтеза и механизмы регуляции метаболизма органических кислот, их связь с общей физиологией микробных клеток. В работе отражен многолетний опыт авторов в промышленном биосинтезе органических кислот. Описываются способы утилизации отходов производства лимонной кислоты с целью получения ценных кормовых продуктов. 

Лимонная кислота НООС-СН₂С(ОН) -СООН-СН₂-СООН является моноокситрикарбоновой кислотой, кристаллизующейся из водных растворов с одной молекулой воды (моногидрат лимонной кислоты) в виде бесцветных прозрачных ромбообразных кристаллов .Моногидратная лимонная кислота имеет молекулярную массу 210, плотность 1,540 г/см³ и температуру плавления 70—75 ^СС. Кристаллизационная вода теряется при хранении и интенсивно выделяется при температурах, превышающих 40—50 °С. При 100 °С вода теряется полностью.

При температуре  кристаллизации 36,6 °С и выше выделяется безводная лимонная кислота с молекулярной массой 192 и температурой плавления 153 °С. При нагревании до 175 °С лимонная кислота разлагается.

Лимонная кислота  хорошо растворяется в воде (1460 г/л  при 20 °С) и умеренно — в этаноле (620 г/л при 25 °С).

          СН₂СООН

    |

НО—С—СООН

           I

          СНзСООН

Соли лимонной кислоты — цитраты — имеют  низкую водораство-римость.

Лимонная кислота  широко распространена в природе. Особенно много ее в незрелых фруктах и  ягодах (лимоны, клюква, яблоки, виноград, брусника и др.),

где лимонная кислота  является естественным консервирующим агентом.

Продуценты  лимонной кислоты

После первых публикаций К.Вемера о способностях микромицетов синтезировать органические кислоты, в том числе лимонную, многие микробиологи стали тщательно изучать физиологию грибов и их биосинтетические способности. Многочисленные проверки показали явно выраженный потенциал сверхсинтеза лимонной кислоты у целого ряда микромицетов, дрожжевых грибов и бактерий. В зависимости от химической природы окисляемого субстрата (свекловичная, тростниковая, цитрусовая или финиковая меласса, сок сахарного тростника, гидрол, гидролизаты крахмала, багасса, сахароза, глюкоза, парафины и много других субстратов) в качестве продуцентов лимонной кислоты в более или менее широких масштабах используют микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и Botrytis, дрожжевые грибы родов Candida, Delaromyces и Torulopsis, а также бактерии родов Arthrobacterium, Pseudomonas и Micrococcus.

Детально изучены  многочисленные представители аспергиллов, особенно Aspergillus awamori, A.aureus, A.clavatus, A.glaucus, A.niger.

Самым широко распространенным продуцентом лимонной кислоты является микромицет Aspergillus niger, физиология и механизм биосинтеза лимонной кислоты которого наиболее изучены. 

В настоящее  время для биосинтеза лимонной кислоты  в качестве основного сырья широко используют мелассу — отходы сахароперерабатывающей промышленности. В зависимости от исходного материала различают свекловичную, тростниковую, цитрусовую и другие виды мелассы. На международном рынке ежегодна продается 30—35 млн. т этого сырья. В России ежегодный объем производства мелассы составляет 3 млн. т. Хотя меласса в основном используется для кормовых целей, ее широко применяют также в микробиологической промышленности.

Свекловичная  меласса характеризуется высоким  содержанием 'Сахаров (46—55%), из которых  преобладает сахароза. Меласса имеет  сложный и непостоянный химический состав. Она содержит коллоиды, органические кислоты, витамины, белки и свободные .аминокислоты, сложный спектр минеральных веществ (табл. 4.8— 4.10). Из нелетучих органических кислот в мелассе могут присутствовать, %: лимонная — 0,01—0,5; глюконовая — 0,5—1,0; яблочная — 0,1—0,5; янтарная — 0,1—0,7.

Хорошо сбраживаемая меласса должна содержать не более 1% инвертного сахара и не более  1%  СаО и 0,06,%  сернистого газа (добавляемого в мелассу в качестве консервирующего агента) при общем содержании сухих веществ не менее 75% и Сахаров не менее 46,%   при невысоком  содержании живых микроорганизмов.

В золе свекловичной мелассы много калия, магния, железа, но относительно мало фосфора.

Химический состав мелассы зависит от климатических  и почвенных условий

выращивания сахарной свеклы, применяемых минеральных удобрений, времени уборки урожая (поздние сроки уборки отрицательно влияют на качество мелассы), технологических нюансов переработки сахарной свеклы, условий транспортировки и хранения мелассы.

Производство  мелассы связано с сезонными доставками сырья. В производстве лимонной кислоты наилучшие результаты дает зрелая, выдержанная меласса. Важное значение имеют длительность хранения мелассы и наличие герметически закрытых емкостей — мелассохранилищ с пневматическим перемешиванием (для предотвращения расслоения), насосами, устройствами для подачи и забора мелассы из разных горизонтальных хранилищ.

В последнее  десятилетие качество мелассы ухудшается под влиянием ряда дополнительных факторов, связанных с техническим прогрессом . Широко применяемые в сельском хозяйстве ядохимикаты и минеральные удобрения могут оставлять определенные отрицательные следы в сельскохозяйственной продукции, в частности в мелассе, где обнаружены инсектициды, например фосфорорганический инсектицид малатилон (до 90 мг в 1 кг мелассы), оказывающий ингибирующее влияние на биосинтез лимонной кислоты .

В мелассе установлено  присутствие некоторых фунгицидов (трилон, мертрилан и др.). Данные о влиянии фунгицидов на биосинтез  лимонной кислоты неоднозначны. Некоторые авторы утверждают, что ряд фунгицидов подавляет активность ферментов изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы и тем самым способствует биосинтезу лимонной кислоты, во всяком случае у дикорастующих культур Aspergillus niger . По данным других авторов, фунгициды отрицательно влияют на ацидогенез.

Обнаружено угнетение  синтеза белка в клетках Aspergillus niger под действием ртутьорганического фунгицида мертрилана. В результате его воздействия на ферменты ЦТК (в частности на малат-, изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы) резко понижаются интенсивность дыхания клеток и активность терминальных оксидо-редуктаз, особенно цитохромоксидазы. Фунгицид трилан (4,5,6-трихлорбензоксазолидон) также отрицательно влияет на метаболизм микромицета Aspergillus niger, по механизм его воздействия другой .

Все исследованные  фунгициды  подавляют  интенсивность  дыхания, тормозят синтез белка, нарушают проницаемость цитоплазматических мембран .

    В   мелассе  нередко обнаруживается  присутствие детергентов.Их влияние на микроорганизмы изучено слабо. Установлено изменение проницаемости клеточной мембраны Aspergillus niger и как следствие   —   повышенная  гидроксилазная   активность   культуры.

Способ  культивирования

    Успехи глубинной ферментации в производстве антибиотиков побудили производителей лимонной кислоты искать пути глубинного культивирования ее продуцентов. В СССР первой глубинное культивирование продуцентов лимонной кислоты освоила группа исследователей под руководством Г. И. Журавского в 50-е гг., применяя синтетические сахарозные среды и специально

селекционированный для глубинного культивирования штамм Aspergillus niger {. В качестве сырья для глубинной ферментации лимонной кислоты может быть использован широкий набор природных субстратов: меласса, глюкоза, сахароза, жидкие парафины и другие источники углерода .

Технология глубинного культивирования продуцентов лимонной кислоты представляет собой явно выраженный двухступенчатый процесс. Первая ступень включает выращивание  посевного материала из конидиоспор в посевной среде (на качалке и в посевном аппарате) при 32—33 °С в условиях хорошей аэрации (0,8—1,0 объема воздуха на 1 объем среды в минуту) и при непрерывном перемешивании среды. Продолжительность культивирования на стадии выращивания посевного материала — 2 сут (1 сут — на качалке, 1 — на посевном аппарате).

Сказанное принципиально  не исключает непосредственного  применения конидиоспор в качестве посевного материала для ос-

новной ферментации, однако это существенно удлиняет цикл ферментации: с 7—8 до 12—13 сут .

Основную ферментацию  в глубинных условиях осуществляют в производственном биореакторе  при коэффициенте его заполнения 0,75—0,80 и количестве посевного материала 5—8% от объема ферментируемой среды. Начальная  концентрация Сахаров — 10— 14%, часто применяют подкормку свежей средой, особенно в случаях применения мелассных сред . Регуляции рН среды не требуется, но поскольку лимонная кислота очень коррозионна и для ферментационного оборудования необходима устойчивая к коррозии сталь, то для смягчения коррозионное практикуют подщелачивание ферментируемого субстрата до рН 3,8—4,2.

Процесс ферментации  имеет черты двух фаз, или стадий: формирования биомассы и кислотообразования.      

Для фазы роста  биомассы характерно объединение молодого мицелия в шарообразные агломераты, формирование которых продолжается до 70—80 ч ферментации. Некоторая часть гиф остается в свободном виде.

Во время интенсивного роста потребность продуцента в  молекулярном кислороде составляет до 1 кг па каждый кубометр ферментируемого субстрата в час. В фазе биосинтеза лимонной кислоты потребность в кислороде в некоторой степени снижается и составляет 0,5—0,6 кг 0₂/м³-ч. Для обеспечения массопередачи кислорода в ферментируемый субстрат вводится стерильный воздух в количестве 0,8—1,0 объема на 1 объем среды в минуту, одновременно с помощью мешалки создается циркуляция среды со скоростью, соответствующей 1,2—1,5 м/с вдоль стенки ферментатора. Насыщение среды кислородом в начальной фазе ферментации должно составлять 20—25,% от полного насыщения, в фазе биосинтеза лимонной кислоты — 10—15,%. Для обеспечения массооб-меиа молекулярного кислорода необходим расход электроэнергии в количестве 1,8—2,2 кВт на 1 м³ среды.

Температурные режимы в ферментируемом субстрате  дифференцированы: в фазе роста биомассы — 32—33 °С, в фазе кислотообразования — 30—31 °С.

В зависимости  от особенностей используемого мутанта  Aspergillus niger применяют разные варианты технологических режимов глубинной технологии.  
 

      1. ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЕЧНОЙ ПРОДУКЦИИ ПРОЕКТИРУЕМОГО ПРОИЗВОДСТВА 

     1.Техническое  наименование продукта – лимонная  кислота (чистота 99,9%).

     2. Лимонная кислота будет выпускаться в соответствии с требованиями      ГОСТ 908—79.

     3.Лимонную  кислоту получают из культуральной  жидкости при глубинном культивировании микроскопического гриба Aspergillus niger с последующим отделением биомассы.