Достижение генной инженерии

Для введения ДНК  в различные культуры клеток млекопитающих  или развивающиеся эмбрионы используют метод микро инъекций ДНК в  ядро с помощью микро­манипулятора. Развитие методов микрохирургии  клеток позволило заменять ядра оплодотворенных  яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать абсолютно  идентичные организмы. Создание гибридов высших растений в обход полового скрещивания возможно путем слияния  протопластов и соматической гибридизации растительных клеток, в результате чего в ряде случаев появляются целые  гибридные растения.

Все эти методы могут быть использованы для конструирования  новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введения и стабильного  наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих, гены,детерминирующие желаемые признаки.Следует, однако, отметить, что, несмотря на очевидные успехи подобных работ по созданию микроорганизмов, синтезирующих ряд важных продуктов эукариотического происхождения, проблема экспрессии чужеродных генов у прокариот имеет ряд ограничений.

 Некоторые  из них связаны с тем, что  при сверхпродукции полезных  для человека и не нужных  клетке соединений, кодируемых гибридной  плазмидой, усиливается неустойчивость  самих гибридов и вероятность  элиминации из них встроенных  генов. Стабильность гибридных  ДНК снижается и с увеличением  размеров вставки в вектор. Поэтому  разрабатываются методы, направленные  на сохранение целостности гибридной  структуры. Использование регулируемых  промоторов предохраняет клетку  от чрезмерной для нее метаболической  активности, связанной с избыточной  продукцией чужеродного белка.  Вместе с тем проблема стабильности  гибридных молекул окончательно  не решена. Ограничения возможностей  конструирования микроорганизмов  — гиперпродуцентов ценных препаратов  распространяются на случаи клонирования и экспрессии любых генов как про -, так и эукариотического происхождения.

Наряду с этим существуют и ограничения, специфически связанные с выражением эукариотических  генов в прокариотах.

Первое из них  определяется тем, что эукариотические  промоторы могут не распознаваться бактериальной РНК - полимеразой.

 Второе заключается  в том, что и РНК транскрибирующаяся  с эукариотических генов, не  содержит последовательности Шайн—Далгарно,  необходимой для ее связывания  с рибосомами.

В-третьих, такая  иРНК может содержать интроны, которые  следует вырезать.

Наконец, эукариотические  белки часто становятся субстратами  для бактериальных протеаз, опознающих такие белки как чужеродные.

Первые два  ограничения преодолеваются за счет создания векторов, несущих собственные  промоторы и последовательность Шайн—Далгарно, третье можно обойти путем использования кДНК либо химически  синтезированных генов. Протеазная активность реципиентных бактерий подавляется  мутациями.

Преодоление всех этих ограничений открывает дальнейшие перспективы использования методов  генной инженерии при создании микроорганизмов  — продуцентов гормонов, вакцин, антисывороток и ферментов, представляющих интерес для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства и микробиологической промышленности. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Методы введения ДНК в бактериальные клетки 

В начале 1950-х  гг., вскоре после открытия Ледербергом  процесса конъюгации Escherichia coli, было установлено, что типы «спаривания» клеток бактерий обусловлены генетически и что  генетическая информация переносится  из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиентные клетки. Способность  служить донорными клетками (или  фактор плодовитости F) передавалась при  конъюгации значительно чаще, чем  любой другой генетический признак. F-фактор передавался также независимо от любого другого известного гена донорной клетки. Ледерберг подметил, что F-фактор напоминает внехромосомные генетические элементы, имеющиеся в  цитоплазме высших организмов. Это  наблюдение позволило ему в 1952 г. присвоить подобным внехромосомным генетическим системам общее название—плазмиды.

В 1953 г. Хэйс, который  в то время работал в больнице Хаммерсмита в Лондоне, установил, что в определенных условиях F-фактор может оказаться сцепленным с  генетическими маркерами и индуцировать последовательный их перенос в ходе конъюгации. F-фактор присоединяется к  бактериальной хромосоме в специфическом  участке (сайте); именно в этой точке  хромосома разрывается при конъюгации и начинается ее перенос в реципиентную клетку. F-фактор способен также отделяться от хромосомы, захватывая подчас небольшие  фрагменты хромосомы; поэтому его  можно рассматривать как виехромосомный элемент, который иногда интегрирует  в хромосому.

Жакоб и Вольман, сотрудники Института Пастера в  Париже, отметили сходство в поведении F-фактора, умеренного бактериофага X, и  другой плазмиды—Со1Е1 (которая кодирует колицин—белок, убивающий клетки Е. coli ). Для обозначения генетического  элемента, который может реплицироваться  либо в свободном состоянии, либо соединившись с бактериальной хромосомой, они предложили новый термин—«эписома».

В 1959 г. в Японии при исследовании больных бактериальной  дизентерией, которые не поддавались  лечению обычно эффективными антибиотиками, было сделано замечательное открытие. В клетках патогенных бактерий (Shigella dysenteriae)  были найдены гены, придававшие  им устойчивость одновременно к нескольким антибиотикам; такая устойчивость передавалась другим кишечным бактериям во многом подобно тому, как передается F-фактор. Эти факторы устойчивости (называемые R-факторами) обладали сходством с F-фактором; так, они были способны индуцировать передачу самих себя от клетки к клетке при конъюгации. Позже удалось показать, что некоторые из них содержат последовательности нуклеотидов, близкие к таковым F-фактора.

В начале 1960-х  гг. Новик обнаружил подобные факторы  устойчивости у стафилококков; они  содержали ген, кодирующий фермент  пенициллин-β-лактамазу, или пенициллиназу; последняя расщепляет пенициллин и  таким образом обеспечивает устойчивость к этому антибиотику. R-факторы  стафилококков, по-видимому, не способны обеспечивать передачу самих себя посредством  конъюгации и переносятся лишь пассивно в процессе трансдукции, т. е. при  их встраивании в ДНК бактериофага. Это открытие указывало на наличие  нескольких R-факторов в клетках  кишечных бактерий.

К середине 1960-х  гг. стало очевидным, что большинство R-факторов кишечных бактерий и стафилококков (как и плазмида Со1Е1) отличаются от F-фактора и фага λ [И.С.1]тем, что  остаются внехромосомными элементами; их обратимого встраивания в хромосому  клетки не происходит. В строгом  смысле они не соответствовали определению  эписомы. В 1963 г. Новик предложил  пользоваться предпочтительно термином «плазмида», как более общим, а  не «эписома». В настоящее время  термин «плазмида» является общепринятым.

Плазмиды найдены  почти у всех видов бактерий. Штамм, содержащий плазмиду, способен давать начало вариантам, у которых плазмида утрачена; в подобных случаях плазмида теряется окончательно, клетка не способна ее регенерировать и может только получить ее из другой бактериальной  клетки.

Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК, по размеру соответствующие 1—3% генома бакте­риальной клетки, однако даже столь  малая часть наследственного  аппарата кодирует важные генетические признаки, которые обычно сама бактериальная  хромосома не кодирует. Например, они  содержат информацию, необходимую для  конъюгации бактериальных клеток, ими  обусловлен ряд заболеваний растений и животных. Они позволяют клеткам  использовать многие сложные соединения в качестве источников питания и  обеспечивают устойчивость к разнообразным  токсичным агентам, особенно к антибиотикам. Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям  ртути и ряду тяжелых металлов, вызывающих летальный эффект (солям сурьмы, висмута, кадмия и свинца, ионам арсената и арсенита). Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. соli. Наличием плазмид  обусловлены также некоторые заболевания с выраженной диарреей, стафилококковый импедиго, створаживание молока и превращение его в сыр молочнокислыми бактериями, а также разнообразные биохимические реакции, характерные для бактерий рода Pseudomonas..  Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis .Использование плазмид в качестве векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужило толчком для интенсивных исследований их структуры и характера репликации.

Количество плазмид  в клетке может колебаться от одной  до более сотни; в целом чем  крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке. Обычно репликация плазмиды регулируется независимо от репликации хромосомы. Поскольку плазмиды могут различаться по количеству копий водной и той же клетке, количество копий ; должно определяться регуляторной системой, присущей самой  плазмиде. Такая система была описана  в 1972 г. датчанином Нордстрёмом из Университета Оденсе для плазмиды R1 Е. со1i; сходные  регуляторные системы были найдены  у плазмид стафилококков. Количество копий плазмиды R1 зависит, по-видимому, от белка или белков, которые подавляют  ее репликацию. Сегмент ДНК длиной не более двух тысяч пар нуклеотидов  управляет репликацией плазмиды, которая более чем в 50 раз его  крупнее.

Долгое время  считалось, что генетическая конституция  всех клеток данного вида одинакова  и не изменяется в течение длительного  времени, однако, как оказалось, значительная часть генетических признаков, причем не только у бактерий, но и у высших организмов, нестабильна (эти признаки имеются в одних клетках или  штаммах и отсутствуют в других,, клетки могут терять их и приобретать  вновь) и мобильна (способна переноситься между клетками или перемещаться в одной и той же клетке из одного локуса в другой). Такая нестабильность объясняетcя тем, что эти признаки определяются плазмидами и тугими атипичными генетическими системами. 

При конъюгации бактериальных клеток может происходить  обмен плазмидами между бактериями, принадлежащими к разным видам и  даже родам, которые не способны обмениваться генами, находящимися в хромосомах. Наконец, такой обмен может приводить  к переносу генов, находящихся в  плазмиде, из одного вида в другой при  совместном росте и конкуренции, в результате чего реципиентные клетки приобретают способность выживать за счет донорных клеток. Эти свойства показывают, что плазмиды способны к выживанию независимо от судьбы содержащих их клеток, они не только не снижают общей приспособленности клетки, но, напротив, снабжают ее дополнительными адаптивными функциями. В самом деле, плазмиды обладают способностью включать в себя новые гены, а уже содержащиеся в них гены «перетасовывают» так, что это, с одной стороны, не влияет на эффективность репликации самих плазмид, а с другой—наделяет клетку резервуаром генетической информации, которую она использует по мере надобности. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Генетическая рекомбинация in vitro

Генетическая  рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. По определению, данному Понтекорво в 1958 г., рекомбинация—это любой процесс, способный привести к возникновению  клеток или организмов с двумя  или более наследственными детерминантами, по которым их родители различались  между собой и которые соединены  новым способом. Такая рекомбинация обязательно происходит у млекопитающих  при образовании половых клеток.

 В ходе  мейоза гомологичные хромосомы  обмениваются генами; именно эти  обмены позволяют объяснить перетасовку  наследственных признаков в ряду  поколений. У вирусов и бактерий  генетическая рекомбинация происходит  реже, чем у животных. Обмен генетическим  материалом, за которым следует  рекомбинация, происходит между  организмами одного и того  же или близких видов. Все  живые организмы обладают рестрикционными  эндонуклеазами, которые узнают  чужеродную ДНК, проникшую в  организм, и расщепляют ее, таким  образом сводя на нет генетическую  рекомбинацию между эволюционно  удаленными геномами.

Обмен генами, равно  как и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно  осуществить посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был  разработан на бактериях, в частности  на кишечной палочке, в клетки которой  вводили гены животных и человека и добивались их репликации.

Метод рекомбинации in vitro заключается в выделении  ДНК из разных видов, получении гибридных  молекул ДНК и введении рекомбинантных молекул в живые клетки с тем, чтобы добиться проявления нового признака, например синтеза специфического белка.

Выделение генов, которые представляют собой сегменты ДНК, осуществляется на основе биохимических  методов; сложность выделения зависит  от величины генома. В то время как  определенный ген вируса выделить относительно просто, для гена человека это очень  сложная задача.

Поэтому исследователи  прибегают к косвенному методу, основанному  на выделении информационной РНК (мРНК). В клетках животных транскрипция мРНК на ДНК осуществляется в клеточном  ядре; молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции 

белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последовательностях нуклеотидов мРНК (т. е. в конечном счете в ДНК). В клетках бактерий (прокариот), которые не имеют ядра, транскрипция и трансляция происходят одновременно и сопряжены; мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. Рибосомы играют ключевую роль в трансляции и в клетках животных.