Изучение элементов химического состава пищевых продуктов (на примере белков)

    HOOC – R – NH2 + 2HCHO → HCHO – R – N(CH2OH)2;

    HCHO – R – N(CH2OH)2 + NaOH → NaOH – R – N(CH2OH)2 + H2O.

    Количество щелочи, пошедшее на титрование кислых карбоксильных групп, пересчитывают на массовую долю белков.

    Исследование  проводят по следующей схеме:

    В колбу вместительностью 100 см³ отмеривают 20 см³ исследуемого продукта, 10-12 капель 1% раствора фенолфталеина и титруют 0,1н раствором гидроксида натрия до появления розовой окраски, соответствующей цвету эталона. Затем вносят прибором для автоматического отмеривания 4 мл нейтрализованного 40% формалина и вновь титруют 0,1н раствором гидроксида натрия до окраски эталона. Количество щелочи, пошедшее на второе титрование (при первом титровании она расходуется на нейтрализацию веществ, обусловливающих кислотность продукта), умножают на коэффициент 0,959 и получают массовую долю белков в продукте в процентах.

    Для перевода количества раствора гидроксида натрия в проценты белка можно пользоваться таблицей.

    Таблица 2 - Зависимость массовой доли белков от объема раствора щелочи, затраченного на титрование проб в присутствии формалина 
 

2.2. Характеристика  качественных методов определения  содержания белков 

    Реакции осаждения белков 

      Белки в растворе и соответственно  в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков, количественной характеристики их устойчивости, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора. 

    Обратимое осаждение. 

    Под действием факторов осаждения белки  выпадают в осадок, но после прекращения  действия (удаления) этих факторов белки  вновь переходят в растворимое  состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. 

    Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором - глобулиновая фракция.

    Сущность  реакции заключается в дегидратации молекул белка.

    Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенной пробы и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок - глобулины. 

    Необратимое осаждение белков. 

    Необратимое осаждение белков связано с глубокими  нарушениями структуры белков (вторичной  и третичной) и потерей ими  нативных свойств. Такие изменения  белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов  минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов. 

    Осаждение при кипячении. Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, так как его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

    Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора пробы. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, так как в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается. 

    Осаждение концентрированными минеральными кислотами. Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

    Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. Затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем пробы. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит. 

    Осаждение органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды.

    Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель раствора пробы. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую - 5 капель трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка. 

    Осаждение белка солями тяжелых  металлов. Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

    Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель пробы. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью - 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра - растворения осадка нет. 

    Цветные реакции на белки 

    Цветные реакции применяются для установления белковой природы веществ, идентификации белков и определение их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. 

    Биуретовая  реакция на пептидную  связь. В основе ее лежит способность пептидных связей (-CO-NH-) образовывать с сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание.

    Ход определения. В пробирку вносят 5 капель раствора пробы, 3 капли NaOH, 1 каплю Cu(OH)2, перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание. 

    Нингидриновая реакция. Сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот. Эта реакция характерна для аминогрупп в -положении, присутствующих в природных аминокислотах и белках.

    Ход определения. В пробирку вносят 5 капель раствора пробы, затем 5 капель нингидрина, нагревают смесь до кипения. Появляется розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое. 

    Ксантопротеиновая реакция. При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты и нагревании появляется желтое окрашивание, переходящее в присутствии щелочи в оранжевое. Сущность реакции состоит в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот азотной кислотой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот.

    Ход определения. К 5 каплям раствора пробы добавляют 3 капли азотной кислоты и (осторожно!) нагревают. Появляется осадок желтого цвета. После охлаждения добавляют (желательно на осадок) 10 капель NaOH, появляется оранжевое окрашивание. 

    Реакция Адамкевича. Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.

    Ход определения. К одной капле пробы прибавляют 10 капель уксусной кислоты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо. 

    Реакция Фоля. Аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы - SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия Na2S. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия (образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и NaOH), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.

    Ход определения. К 5 каплям раствора пробы прибавляют 5 капель реактива Фоля ( к 5% раствору ацетата свинца прибавляют равный объем 30% раствора NaOH до растворения образовавшегося осадка). и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин. появляется черный или бурый осадок. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3. Эксперементальная часть

    3.1. Обоснование выбора объекта исследования 

    Я выбрала в качестве объекта своего исследования яйцо куриное, так как оно является основным источником белка и многих необходимых для организма человека веществ, и яйцо входит в рацион питания каждого человека.

    Ежегодно  в мире потребляется около биллиона, то есть тысячи миллиардов яиц. Каждый человек съедает в среднем около 200 яиц в год. Но яйца - это не просто обычный продукт питания.