Противовирусные препараты

4.5. Амиксин – возможности и перспективы применения в клинической практике

 

Изыскание и изучение новых фармакологических  средств является одной из важнейших  проблем современной медицины. Успех  в производстве нового лекарственного препарата – это результат глобальной долгосрочной стратегии. При этом шансы на успешное завершение работ по созданию нового лекарства весьма незначительны, примерно 1 к 5000 – 10000, а процесс разработки и продвижения на рынок нового препарата  занимает 12-15 лет.

Разработка новых лекарственных средств борьбы с заболеваниями 21 века является приоритетным направлением деятельности компании «ЛЭНС-Фарм». Особый интерес вызывают препараты, повышающие сопротивляемость организма к инфекционным факторам. Одним из таких препаратов является Амиксин.

СХЕМА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ ИНТЕРФЕРОН

Путь Амиксина в клиническую  практику включал в себя ряд последовательных этапов прохождения разрешительных инстанций. Все параметры эффективности  и безопасности подтверждены документально, начиная с исходного состояния до измерений, проводимых в процессе экспериментального лечения (форма дозировки, способ применения, режим приема, план подбора дозы, срок лечения). К настоящему времени сформировалось представление о потенциально эффективных курсах лечения Амиксином и потребности в нем в первую очередь при заболеваниях, для лечения и профилактики которых не существует удовлетворительных методов. При этом уточнялись влияние выбранных заболеваний на пациентов и общество в целом, недостатки, которые присущи существующим способам лечения, характеристики, которыми обладает Амиксин для улучшения любого из имеющихся способов лечения.  Экономическая оценка основывалась на данных сравнения с альтернативными действиями. Особое внимание уделялось ответам на вопросы, во что обходится пациенту и (или) обществу получение желаемого результата. Доказательства эффективности и экономической целесообразности лечебно-профилактических возможностей Амиксина  явились основанием для включения препарата в стандарты лечения и профилактики, а также  компенсации стоимости лечения Амиксином при таких заболеваниях, как вирусные гепатиты, грипп и другие острые респираторные инфекции, геморрагические лихорадки.

Весьма важным явилось создание по результатам исследований информационно-аналитического сборника. При обобщении опыта применения Амиксина определяющая роль отводилась формализованным методам, что позволило выработать наиболее согласованные рекомендации для реальной практики. Ценность представляемой в настоящем сборнике информации определяется с одной стороны - научной обоснованностью, признаваемой ведущими учеными и специалистами, с другой - связью с решением вопросов целенаправленного и рационального использования Амиксина  в реальной практике.

        Амиксин обладает противовирусным действием в отношении широкого круга вирусов.

Амиксин индуцирует образование интерферона  как первого (альфа, бета), так и  второго (гамма) типов.

Амиксин  «включает» синтез интерферона  в отличие от поликлональной индукции в определенных популяциях клеток.

Индукция интерферона осуществляется  без вспомогательных клеток, что  доказано в экспериментах с чистой культурой, в частности - Т клеток.

По интенсивности и продолжительности  действия Амиксин проявляет лучшие качества индукторов: «выработка» позднего  интерферона, время максимального ответа 10 - 18 часов.

 Доклинические исследования противовирусная активность препарата

Противовирусная активность Амиксина оценивалась на лабораторных животных, инфицированных возбудителем геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) - вирусом Хантаан. Использовались профилактическая, лечебно-профилактическая и лечебная схемы введения препарата белым мышам. Установлена наибольшая противовирусная активность Амиксина при использовании лечебно-профилактической схемы перорального введения в дозе 10 мг/кг.

Противовирусная активность Амиксина и его влияние на интерфероновый статус при гепатите  исследовались  на самцах белых нелинейных мышей  массой 16-18 г. Вирус (штамм Мещерина) пассировали путем внутрибрюшинного заражения белых мышей. Для воспроизведения энтерального гепатита мышам перорально вводили по 0,2-0,3 мл 30-40% суспензии печени зараженных животных на физиологическом растворе. За 1-7 дней  до заражения животным опытной группы перорально вводили Амиксин в дозе 4 мг. За животными наблюдали 14 дней. Однократное введение амиксина 4 мг обеспечивало 40-50% защиту животных от энтерального заражения мышей в течение 72 часов после введения препарата.

Изучено профилактическое и лечебное действие Амиксина в концентрации 0,25 г на кг веса против вируса лихорадки Западного Нила в опытах на белых мышах. Профилактическое введение Амиксина приводило к снижению летальности в опытной группе в среднем на 23,4%.

5. ПОЛУЧЕНИЕ противовирусных ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

1. Новые пути синтеза хлоргидрата тилорона

 

(2,7-бис-[2-(диэтиламино)этокси]-флуорен-9-он

Синтезирован двумя способами  тилорон-2,7-бис[(диэтиламино)этокси] флуоренон-9(I)

Нитрованием флуоренона-9(II) HNO₃ получен 2,7-(O₂N)₂-II (Т. пл. 289 – 91º), восстановленный ZnCl₂ в HCl и AcOH до 2,7-(H₂N)₂-II (Т. пл. 287 – 9º), диазотированием которого NaNO₂ в 50%-ной HBF₄ получено соответственно бис-диазосоединение (III) переведенное действием 50%-ной H₂SO₄ в 2,7-(HO)₂-III (IV, т. пл. 320 – 2º). Ацетилированием флуорена (V) AcCl и AlCl₃ синтезирован 2,7-Ac₂-V (т. пл. 180 – 2º), превращенный действием 3-ClC₆H₄COOOH в присутствии F₃CCOOH в 2,7-(AcO)₂-V (VI), который окислен Na₂Cr₂O₇ в AcOH до 2,7-(AcO)₂-II (VII). Взаимодействием IV или VII с KOH и Et₂NCH₂CH₂Cl*HCl получен I.

0,099 моля 85%-ной 3-ClC₆H₄COOOH прибавляют к охлажденной смеси 0,037 моля 2,7-Ас₂-V, 400мл ХЛФ и 0,3мл F₃CCOOH, защищают от света, нагревают до 20ºС, выдерживают три дня, хлороформный раствор промывают насыщенным раствором Na₂CO₃ и насыщенным раствором NaCl, органический слой сушат безводным MgSO₄, фильтрат упаривают, получают IV, выход 62%, т. пл. 165 – 7ºС

0,034 моля VI, 0,01 моля Na₂Cr₂O₇*2H₂O, 30мл АсОН кипятят 45 минут, раствор охлаждают, прибавляют 50мл воды, выделяют VII, выход 53%, т.пл. 224,5-6,5º (СП).

0,04 моля Et₂NCH₂CH₂Cl*HCl, 0,08 моля KOH, 0,01 моля IV или VII 0,5г PhCH₂NMe₃Br, 200мл толуола и 50мл воды кипятят 24 часа, после охлаждения отделяют органический слой, промывают водой, насыщенным раствором NaCl и высушивают безводным MgSO₄, толуол упаривают в вакууме, масло растворяют в 5мл МеОН прибавляют к 50 мл эфирн. ненасыщенного HCl. Выделяют ди-ХГ (I) 50%, т.пл. 232 – 4º (изо-PrOH-MeOH, 3:1).

2. Получение бонафтона (6-бром-1,2-нафтохинон)

 

Получение 6-бромнафтохинона-1,2 с нитрозодисульфонатом калия

Реакцией β-нафтол с Br₂, в лед АсОН получен с выходом 76% 6-бромнафтол-2(I), т.кип. 200 - 5º /20 т.пл. 128ºС. Взаимодействием I c ON(SO₃K)₂ в дистиллированной воде при добавлении 1/6 н KH₂PO₄ приводит к 6-бромнафтохинону-1,2, т.пл. 170º(разл).

Бонафтон – ¹⁴С 

Разработан метод синтеза [8 –  ¹⁴С]-6-бром-1,2-нафтохинона (I, бонафтона), обладающего противовирусной активностью, взаимодействием 4-MeOC₆H₄CH₂CH₂CH₂Br с Mg и ¹⁴CO₂ получают 4- MeOC₆H₄CH₂CH₂CH₂-¹⁴COOH (II). Циклизация (II) ПФК дает [1-¹⁴С]-7-метокси-1-тетралон (III), восстановление которого на Pd/С приводит к [1-¹⁴С]-7-метокситетралину (IV). Дегидрирование IV при помощи тетрахлор-1,2-бензохинона приводит к [1-¹⁴С]-7-метоксинафталину(V-неролину-¹⁴С) из V и HBr получают [8-¹⁴С]-2-нафтол(VI), бромирование которого дает [1-¹⁴C]-3,8-дибром-7-оксинафталин (VII). Из VII получают [8-¹⁴C]-6-бром-2-нафтол (VIII). Реакция VIII с ON(SO₃K)₂ приводит к (I).

5.3. ГОССИПОЛ

 

2,2-бис-(1,6,7-триокси-3-метил-5-изопропил-8-альдегидонафтил)

C30H30O8 Мол. масса  518.57 Т.пл. 180-181°C

 

Госсипол представляет собой кристаллический  канареечно-желтый порошок без запаха.

Растворим - в спирте, эфире, ацетоне, хлороформе, пиридине.

Не растворим - воде.

Качественные реакции. Кристаллик госсипола с каплей конц. серной кислоты на часовом стекле дает пурпурно-красное окрашивание.

Диоксим C₃₀H₃₂O₈N₂. В колбе с обратным холодильником нагревают на водяной бане 0.5 г госсипола, 1 г гидроксиламина гидрохлорида, 5 мл пиридина и 5 мл абсолютного спирта. Растворитель концентрируют под тягой, к остатку прибавляют спирт. Выпадают кристаллы; их отделяют и перекристаллизовывают из спирта. Т.пл. 312°C.

Госсипол является одним из главных  пигментов хлопчатника, известен в  трех таутомерных формах. Обладает свойствами антиоксиданта, щелочные растворы поглощают свободный кислород воздуха. Ядовит.

В ядрах семян и других частях хлопчатника содержание госсипола  в среднем составляет 1%. В процессе производства хлопкового масла он превращается в глубоко окрашенные не токсичные соединения, затрудняющие рафинацию масла.

В настоящее время наряду с фармацевтической отраслью применяется для получения полимерных материалов, преимущественно лаков.

5.4. ПОЛУЧЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА

 

Способность лейкоцитов человека продуцировать интерферон была показана вскоре после открытия системы интерферона Айзексом /Франция/.

Методика заключается в следующем.

Из периферической крови доноров  выделяют лейкоцитарную массу и  подвергают культивированию в суспензии. Используют среду №1, в которую добавляют 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. К лейкоцитам в концентрации (5-10)*10⁶клеток/мл в качестве индуктора добавляют вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 10⁸/мл ТЦД₅₀ в культуре куриных фиброластов. Продуцированный интерферон отделяют от культуральной среды путем центрифугирования.

ПОЛУЧЕНИЕ БЕТА -ИНТЕРФЕРОНА

Еще в 60-е годы было показано, что  интерферон, провоцируемый клетками амниона человека, а также кожно-мышечными  фибробластами, по своим свойствам отличается от лекоцитарного интерферона. В настоящее время для получения бета-интерферона используют диплоидные клетки человека. Супериндукцию осуществляют различными воздействиями - дихлоро-1-бета-D-рибафуранозилбенэимидазолом, хлороквином, нейтральным красным, УФ~радиацией и др.

ПОЛУЧЕНИЕ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА

Гамма-интерферон является продуктом  Т-лимфоцитов человека. За последнее  десятилетие благодаря усиленному изучению иммунного ответа и свойств  иммунокомпетентных клеток значительно расширились представления о функциях Т-лифоцитов, а также о продуктах, выделяемых Т-лимфоцитами - лимфокинах, обладающих свойствами биорегуляторов.

Гамма-интерферон, или иммунный интерферон, также является одним из активных регуляторов иммунного ответа, так как обладает супрессорной активностью в отношении продукции антител, вызывает активацию естественных киллеров.

Гамма -интерферон продуцируют активированные Т-лимфоциты.

Для получения больших количеств  гамма-интерферона из периферической крови выделяют Т-лимфоциты и обрабатывают митогеном или антилимфоцитарной сывороткой. Например, к культуре с концентрацией лимфоцитов (I-2)*10⁵ в 1 мл прибавляют стафилококковый энтеротоксин в концентрации 0,02 мкг/мл.

Культуры инкубируют в среде  с человеческим альбумином. Интерферон выделяют из культуральной среды. Возможно повторное стимулирование культуры и повторное продуцирование интерферона.

ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН

Характеристика готового продукта,

Человеческий лейкоцитарный интерферон является видоспецифическим гликопротеидом, синтезируемым донорскими лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногена.

Специфичность препарата определяется следующими признаками:

А) противовирусной активностью. В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса, взятого в дозе 100 ТЦД₅₀

Б) устойчивостью активности к действию нуклеаз-РНК-азы и ДНК-азы;

В) чувствительностью активности к действию трипсина - при концентрации фермента 300 мкг/мл в течение I часа при 37°С препарат полностью инактивируется;

Г) чувствительностью активности к действию специфической антисыворотки - антиинтерфероновая сыворотка в разведении, соответствующем титру должна снижать защитное действие интерферона, взятого я количестве 10 ед, в реакции нейтрализации.

 

Основные требования к препарату:

Препарат должен быть вирусологически  стерильным, нетоксичным и безвредным.

В разведении, соответствующем титру  активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса.

Сухой препарат - пористый порошок  серовато-коричневого цвета, легко  растворимый в 2 мл дистиллированной воды. Остаточная влажность не должна превышать 2%,

Раствор препарата должен иметь  различные оттенки красного цвета и желтоватый оттенок.

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

Кровь заготавливают на станциях переливания  крови в соответствии с действующими инструкциями, в стерильные многокамерные  мешки или флаконы, заполненные  консервирующим раствором.

Пластикатные мешки центрифугируют 4 мин при 4°С и из них выжимают последовательно - плазму, а затем 40 мл верхнего слоя с поверхности клеточной  фракции (эритромасса) или 40 мл верхнего слоя клеточной фракции (лейкомасса), которые используют в дальнейшем в качестве источника лейкоцитов для биосинтеза препарата.

Образец крови, плазмы, эритромассы  или лейкомассы от каждого донора, должен контролироваться на отсутствие инфицирования сифилисом, гепатитом, СПИДом в соответствии с действующими инструкциями. При отрицательных результатах контроля эритромасса и лейкомасса могут использоваться для производства интерферона не позднее, чем спустя сутки после забора крови от донора. Хранение их допускается при температуре не выше 4°С.