Репарация ДНК

Общая схема эксцизионной репарации, действующей по принципу «режь-латай», включает несколько этапов:

1. Узнавание повреждения УФ-эндонуклеазой (у E.coli этот фермент называют UvrABC-эндонуклеазой);

В случае пиримидиновых димеров или моноаддуктов повреждение распознается легко. В других случаях, например, при неправильном спаривании нуклеотидов, оба нуклеотида (правильный и неверный) эквивалентны для многих видов эксцизионной репарации, однако существуют специализированные системы, позволяющие в большинстве случаев восстанавливать нативную структуру.

2. Инцизия (надрезание) цепи ДНК этим ферментом по обе стороны от повреждения; 

3. Эксцизия (вырезание и удаление) фрагмента ДНК, содержащего повреждение, происходит при участии геликазы - фермента, расплетающего молекулу ДНК для высвобождения концов после первичных надрезов;

4. Ресинтез, в ходе которого ДНК-полимераза I застраивает образовавшуюся брешь благодаря своей 5'-3'-полимеразной активности, а ДНК-лигаза ковалентно присоединяет 3'-конец вновь синтезированного материала к ранее синтезированной ДНК.

Эксцизионная репарация ДНК завершается при возникновении ковалентных связей репарированного участка со скелетом полинуклеотида. Таким образом, обеспечивается непрерывность в ранее поврежденной цепи двухцепочечной молекулы ДНК. В целом, эксцизионная репарация обычно распознает нарушения вторичной структуры ДНК (двойной спирали) и вырезает их.

У Е. coli выделяют три вида эксцизионной репарации, различающихся по длине вырезаемых фрагментов поврежденной ДНК (короткие, длинные и очень короткие).

Эксцизионная репарация коротких фрагментов является конститутивной и контролируются системой uvr-генов (А, В, С, D). Размер вырезаемого фрагмента цепи ДНК составляет около 20 оснований. Комплекс UvrAB распознает повреждение (пиримидиновый димер, моноаддукт), затем UvrA отсоединяется, a UvrC присоединяется, новый комплекс осуществляет разрез на 7 нуклеотидов в 5'-сторопу от повреждения и 3—4 нуклеотида в другую. UvrD продуцирует геликазу, которая раскручивает ДНК для высвобождения концов цепей. Этап эксцизии обычно осуществляется ДНК-полимеразой I, которая помимо полимеразной имеет и экзонуклеазную активность. Этот фермент, как правило, застраивает короткие участки (до 30 нуклеотидов). ДНК-полимераза II способна вырезать и застраивать более длинные бреши (до 1 000-1 500 нуклеотидов). Такие же функции присущи экзонуклеазе VII. Таким образом, отдельные этапы могут выполняться различными ферментами, что повышает надежность системы. Данный тип репарации ДНК удаляет примерно 99% моноаддуктов.

Эксцизионная репарация длинных повреждений контролируется той же системой генов, однако, является индуцибельной. Размеры вырезаемых фрагментов в отдельных случаях могут превышать и 9 000 нуклеотидов.

К специализированным системам эксцизионной репарации ДНК можно отнести эксцизионную репарацию очень коротких фрагментов. Она специфически удаляет Т в парах GT и СТ, используя продукты генов mutL и mutS. Другая система подобного рода, основанная на работе гена mutY, кодирующего аденингликозилазу, вырезает А в парах AG и АС. Эти системы могут работать очень успешно вскоре после синтеза ДНК.

 

2.3 Мисмэтч-репарация

Мисмэтч-репарация исправляет ошибки, возникающие в результате нарушения комплементарности пар AT или GC в дочерней цепи при включении в них некомплементарных нуклеотидов. Особенность данного механизма, состоит в том, что он способен отличить «старую» цепь ДНК от «новой» и исправить именно вновь синтезированную. В основе данного феномена лежит то важное свойство, что материнская цепь несет в последовательностях GATC аденины с присоединенными к ним сразу после окончания репликации метальными группами.

Вследствие этого во время следующего цикла репликации материнская и дочерняя цепи становятся структурно различимыми, так как до окончания данного цикла дочерняя цепь остается неметилированной. Именно в этот временной промежуток и должны быть исправлены ошибки спаривания оснований. Генетическая репарация неспаренных оснований обнаружена в клетках и человека, и дрожжей. Механизм коррекции ошибок такого типа, базирующийся на сочетанном действии продуктов четырех генов mut (И, L, S и U) и получивший название «система MutHSLU», достаточно хорошо изучен у E. coli. Такое взаимодействие протекает в несколько этапов, на первом из которых к паре некомплементарных оснований присоединяется MutS — белковый продукт гена mutS, распознающего нарушения такого типа. Соединившись с участком, включающим неправильное основание, этот белок сразу же образует комплекс и с продуктом гена mutt. Сформированный трехчленный комплекс активирует продукт гена тutН (до этого момента находившийся в латентном состоянии) для связывания с ближайшей неметилированной последовательностью GATC. Обладающий эндонуклеазной активностью продукт гена тutН может разрезать дочернюю цепь как с 5'-, так и с З'-стороны от аденина. В первом случае к белку MutH присоединится экзонуклеаза, которая разрушит дочернюю цепь в направлении 5'-3' до места неверного спаривания и несколько дальше. А во втором — другая экзонуклеаза, c 3'-5'-активностью, двигаясь по дочерней цепи ДНК, также разрушит ее ошибочный фрагмент. Дальнейший ход событий аналогичен описанным этапам ресинтеза и лигирования концов в ходе эксцизионной репарации. Механизм коррекции, при котором восстановлению подвергается определенная цепь ДНК, называется направленным. Эксцизионная репарация обнаружена как у простейших, так и в культуре клеток млекопитающих. В частности в культуре клеток здоровых людей после облучения ее ультрафиолетом через 20 ч из ДНК исчезает до 90% тиминовых димеров (со скоростью около 40 000 димеров в час).

Пострепликативная репарация осуществляется в тех случаях, когда повреждение доживает до фазы репликации (слишком много повреждений, или повреждение возникло непосредственно перед репликацией) или имеет такую природу, которая делает невозможным его исправление с помощью эксцизионной репарации (например, сшивка цепей ДНК). Важная характеристика пострепликативной системы репарации - точность синтеза ДНК, не уступающая той, что наблюдается при обычной репликации.

Эта система играет особенно важную роль у эукариот, обеспечивая возможность копирования даже с поврежденной матрицы (хотя и с увеличенным количеством ошибок). Одна из разновидностей этого типа репарации ДНК-рекомбинационная репарация.

Данный вариант пострепликативной репарации использует рекомбинацию для получения неповрежденной копии генетического материала. Этот тип репарации ДНК был открыт в клетках мутантов E. coli, неспособных выщеплять тиминовые димеры.

После действия ультрафиолета  в таких клетках с помощью ДНК-полимеразы III синтезируется ДНК с одноцепочечными пробелами-брешами, которые исчезают при последующей инкубации клеток в питательной среде за счет рекомбинации между двумя сестринскими дуплексами. У Е. coli эти обмены осуществляются с помощью продуктов генов rec (А, В и С). Кроме них, в заключительном этапе ресинтеза и сшивания участвуют ДНК-полимераза I илигаза.

Механизм пострепликативной репарации ДНК, происходящей уже в первые минуты после облучения, наименее специфичен, гак как отсутствует этап узнавания повреждения. Это быстрый способ восстановления нативной структуры, по крайней мере, части дочерних молекул ДНК. Таким образом, данная система позволяет полностью пройти процессу репликации на матрице поврежденной ДНК, но не удаляет повреждения: оно остается в исходных родительских цепях и может быть удалено на других этапах клеточного цикла, например, с помощью эксцизионной репарации.

 

2.4 SOS-репарация

Существуют системы генетической репарации, при которых точность синтеза невысока. Они являются индуцибельными, и, очевидно, обусловлены необходимостью синтеза ДНК даже на матрице, содержащей повреждения. При этом синтез ДНК на матрице, оставшейся неповрежденной, будет сопровождаться большим количеством ошибок. Индукцию процессов репарации, сопровождающуюся увеличением числа ошибок последней, обнаружил в 1953 г. Дж. Уэйгл (при заражении УФ-облученных клеток Е. coli облученным же фагом X).

В честь первооткрывателя этот тип генетической репарации в 1974 г. М. Радман назвал W-реактивацией (Weigle-reactivalion). W-реактивация дает возможность многим димерам пиримидина, возникающим в бактериальной клетке, дожить до периода синтеза ДНК. Хотя такая ДНК и содержит значительное количество ошибок, поврежденные клетки действительно «спасаются» на каком-то этапе, если только жизненно важные функции не оказались безнадежно нарушенными. Тогда же было показано, что реализация этого механизма возможна только при наличии продуктов генов гесА и lexA.

М. Радман в 1974 г. и Э. Виткин в 1975 г. сформулировали представления об индуцибельной системе генетической репарации, включающейся при появлении затруднений в синтезе ДНК, возникших вследствие сохранившихся димеров, число которых должго быть не менее 30-60. В связи со спасательными функциями этой системы репарации ДНК она была названа SOS-репарацией.

Таким образом, важная особенность  прокариотических и эукариотических клеток состоит в их способности увеличивать эффективность генетической репарации при высокой дозе повреждений. Это возможно в результате индукции новой или модификации одной из пресушествующих ДНК-полимераз за счет белковых продуктов генов, активируемых повреждающими агентами. Например, появление таких ферментов в случае УФ-облучения обеспечивает транедимерный синтез ДНК, в результате которого напротив тиминового димера будет находиться не брешь, а какой-либо нуклеотид. Разумеется, такая произвольная подстановка нуклеотида во вновь образующуюся цепь ДНК часто приводит к ошибкам репликации.

В клетках Е. coli сигналом для индукции SOS-репарации служит замедление синтеза ДНК. Ответом на этот сигнал является ингибирование клеточного деления, индукция эксцизионной репарации с длинными вырезаемыми фрагментами и затем — рекомбинационной репарации.

По-видимому, непосредственным стимулом к запуску механизмов SOS-репарации служит накопление одноцепочечных разрывов ДНК, индуцирующее протеазную активность белка RecA который специфически взаимодействует с белком LexA -репрессором для генов rec (В, С, Е, F, J) и uvrB. Разрезание белка LexA приводит к снятию репрессии и запуску синтеза белковых продуктов указанных выше генов. Кроме того, разрезание белка LexA приводит к кратковременному увеличению его синтеза в клетке, поскольку данный белок является репрессором собственного гена (аутогенный контроль). Далее в результате работы репарационных систем происходит уменьшение количества одноцепочечных разрывов в ДНК, тем самым снижается индуцирующий SOS-репарацию сигнал, белок RecA теряет протеазную активность, и механизмы SOS-репарации выключаются.

 

   3.  Интересные факты 

   * Полагают, что от 80% до 90% всех раковых заболеваний связаны с отсутствием репарации ДНК.

   * Повреждение ДНК  под воздействием факторов окружающей  среды, а также нормальных метаболических  процессов, происходящих в клетке, происходит с частотой от нескольких сотен до 1000 случаев в каждой клетке, каждый час.

4. Генетические мутации

 

Генетика – наука сравнительно молодая. Лишь на рубеже 18–19 веков были сделаны попытки оценить наследственность людей. Мопертюи в 1750 году впервые предположил, что различные патологии могут передаваться по наследству. Затем в 19 веке были выявлены некоторые закономерности. Но официальной датой рождения генетики принято считать весну 1900 года, когда независимо друг от друга голландский ученый Г. де Фриз немецкий Корренс и австрийский ученый Чермак «переоткрыли» законы Менделеева, что и дало толчок к развитию генетических исследований. Уже в 1901–1903 годах Г. де

Фризом была создана мутационная  теория, постулаты которой справедливы  и сегодня: мутации возникают  внезапно, устойчивы, могут быть прямыми  и обратными и, наконец, могут  возникать повторно.

 

4.1. Генотипическая изменчивость

 

Генетика изучает процессы преемственности  жизни на молекулярном, клеточным, организменном и популяционном уровне. Генетика человека говорит о законах наследственности и изменчивости у человека в норме и при патологиях. Так что же такое изменчивость? Генотипическая изменчивость – изменения, произошедшие в структуре генотипа и передаваемые по наследству.

К этому типу изменчивости относят  комбинативную и мутационную изменчивости, которые ведут к увеличению внутривидового разнообразие в природе.

Предполагалось, что именно изменчивости таких типов мутаций и сыграли  немаловажную роль в мировой эволюции.

 

4.2. Комбинативная изменчивость

 

Комбинативная изменчивость возникла с появлением полового размножения, она связана с различными вариантами перекомбинации родительских задатков и является источником бесконечного разнообразия сочетаемых признаков. Так, дети, рожденные в разное время  у одной родительской пары, похожи, но всегда отличаются рядом признаков.

Комбинативная изменчивость обуславливается  вероятностным участием гамет в  оплодотворении, имеющих различные  перекомбинации хромосом родителей. При  этом минимальное число возможных  сортов гамет у мужчин и женщин огромно, оно равно 223 (без учета  кроссинговера). Поэтому вероятность  рождения на земле двух одинаковых людей ничтожно мала.

 4.3. Мутационная изменчивость

 

Мутационная изменчивость связана  с процессом образования мутаций.

Мутации – это внезапные стойкие  скачкообразные изменения в структуре  генотипа. Организмы, у которых произошла  мутация, называются мутантами.

Мутационная теория была создана, как  говорилось выше, Гуго де Фризом в 1901–1903 гг. На основных ее положениях строится современная генетика: мутации, дискретные изменения наследственности, в природе спонтанны, мутации передаются по наследству, встречаются достаточно редко и могут быть различных типов. В зависимости от того какой признак положен в основу, на сегодняшний день существует несколько систем классификации мутаций.

Классификация мутаций:

1. По способу возникновения.

Различают спонтанные и индуцированные мутации