Стероидтарды алу технологиясы

  Холестериннен стероидты гормондар түзілу үрдісінде ең бірінші прегненолон – стероидтар және кортикостероидтардың негізгі аралық биосинтез өнімі түзіледі.Прегненолонның 3ОН тобының С=О-ға тотығуы екіншілік байланыстың орын ауыстыруымен қатар жүреді; бұл кетостероидизомеразалық реакцияның өнімі – прогестерон – плацента мен сары денешіктің гормоны.

 Прегненолон одан басқа ер жыныс гормондарының (тестостерон) және әйел жыныс гормондарының (эстрогендер – эстрон және эстрадиол) ізашары болып табылады. Бүйрек үсті безінің қыртысында прогестерон кортикостеронға және кортизолға айналады (гидрокортизон); ересек адамда кортизол секрециясы күніне 15-30 мг-ды құрайды. Бұл заттар ең алғаш рет бүйрек үсті безінің қыртысынан кристалл түрінде бөліп алынған.

  Кортизол (гидрокортизон) және оның преднизолон және дексаметазон сияқты синтетикалық аналогтары өзінің ісуге қарсы, десенсибилизациялық қасиеттеріне және шокқа қарсы әрекетіне байланысты экстренді терапияның жаңа әдістерінің қатарына жатады. Химиялық құрылысы бойынша ол 11-дезоксистероидтар, 11-гидроксистероидтар, 11, 17-дигидроксистероидтарға (кортизон және гидрокортизон жатады) жіктеледі.

 

1.2.2 Стероидтардың негізгі микробиологиялық айналулары.

        Жоғарыда айтылған бағалы дәрілік препараттарды өндірістік жағдайда өндіру тек микробиологиялық биоконверсияның әдістері, дәлірек айтқанда микробиологиялық трансформация әдісін жетілдіріп, дамытқан кезде ғана мүмкін бола бастады. Әдете шикізат ретінде диосгенин (диоскорея өсімдігінен алынады), соялық бұршақтардан алынатын стигмастерин және соңғы кездері әрі арзан, әрі қолайлы субстрат - β-ситостерин қолданылады. 2-кестеде өндірісте қолданылатын стероидтардың кейбір трансформациялары берілген.

2-кесте.  Өндірісте қолданылатын стероидтардың  микробиологиялық трансформациялары.

Реакция	Субстрат	Өнім	Микроорганизм- трансформатор
11α-гидроксилираттау 11β-гидроксилираттау 16α-гидроксилираттау   1,2-дегидрлеу Бүйірлік тізбекті ыдырату	Прогестерон S заты 9α- фторкортизол Гидрокортизон β-ситостерин	11α-гидроксипрогестерон Гидрокортизон 9α-фтор-16α- гидроксикортизол Преднизолон Андростадиендиоп немесе андростендион	Rhizopus nigricans Culvularia lunat Streptomyces roseochromogenus Arthrobacter simplex Mycobacterium spp.

   Белгілі бір әдіспен модифицирленген стероидтардың өзі де бір мақсатқа бағыталған трансформациясын жүзеге асыруда субстрат қызметін атқара алады. Мысалы, гидрокортизон, кортизон және преднизолон синтезіндегі негізгі зат – Рейхштейннің  S заты (4-прегнен-17α, 21-диол-3,20-диол) болып табылады. Оны қысқаша түрде «S заты» деп атайды. Ол өз кезегінде Corynebacterium mediolanum культурасының көмегімен жүзеге асатын моноацетаттың биотрансформациясы нәтижесінде алынған (R заты – 21-ацетат-5-прегнен-3β,17α,21-триол-20-ОН) модифиццирленген өнім болып келеді:

 

 

  Гидроксилді топты енгізу. Микробиологиялық гидроксилдеу – жиі қолданылатын маңызды әдіс. 3, 11, 16, 17 көміртек атомдарындағы гидроксилді топтардың болуы көптеген гормональды препараттардың физиологиялық белсенділігіне тікелей әсері бар.

 Стероидтарды гидроксилдеу көптеген микроорганизм түрлерімен жүзеге асады, ең жиі қолданылатын – саңырауқұлақтар, тіпті олардың кейбір түрлерінің конидиялары да гидроксилдеу белсенділігіне ие. Стероидтарды Rh.nigricans саңырауқұлағы көмегімен гидроксилдеу – кеңінен таралған, микроорганизмдердің спецификалық әрекетін айқындайтын микробиологиялық әдіс.

Rhizopus nigricans бейнесі

  11α-гидроксилдеу кортизон алудың аса маңызды әдісі болғандықтан, толығымен зерттеліп, өнідірісте кеңінен қолданылып келе жатыр және юұл әдіс көмегімен өнім шығуы өте жоғары болады.

  T.orchidis культурасының көмегімен S Рейхштейн затынан тереңдік өсіру арқылы гидрокортизон алу тәсілінің мақсатты өнім шығуы жоғары болады. 17-сағаттық культура 10 сағатта 70%-ға дейін Рейхштейн затын алуға мүмкіндік береді, ал ондағы гидрокортизон шығуы – шамамен 52%.

 Bacillus cereus микроорганизмі көмегімен 14α-гидроксипрогестерон алу – бактериялар көмегімен гидроксилдеудің аз ғана мысалдардың бірі. Ал 15α-гидроксилдеу көптеген микроорганизмдер көмегімен жүзеге асады, негізгілері – Fusarium және Penicillum түрлері.

 

1.3 Микробиологиялық трансформация үрдістерін жүргізу технологиясы.

         Микробиологиялық трансформацияны жүргізу үшін алдымен 100-200 мг мөлшерінде стероидты шайқағыш колбаларға енгізеді. 1-2 г стероидты шыны ферментерларға салады. Өндірісте көбінесе аэрациялайтын қондырғымен, араластырғыштармен қамтамасыз етілген болаттан жасалған аппараттарды қолданады.

   Шыны ферментерға (қосымша Б) қатаң түрдегі асептикалық жағдайда алдын-ала трансформациялайтын культура қосылған стерильді қоректік ортаны құяды. Қоректік орта стерилизациясын бокста 110-120⁰С-та бактериацидті лампамен жасайды. Қоректік ортаны құю, үлгіні іріктеу операцияларын газды жанарғының жалынында жүзеге асырады. Микроорганизм-трансформатордың өсу уақыты оның максимальды трансформациялық белсенділігімен анықталады, культураға байланысты ол бірнеше сағаттан бірнеше күнге дейін созылуы мүмкін.

  Стериндердің суда ерігіштігі өте нашар. Қазіргі кезде тотықтыруға арналған стериндерді аздаған мөлшерде (1 г/л шамасында) уыттылығы аз, сумен араласқан еріткішпен (ацетон, спирт, диметилформамид) төмен концентрацияда қосады. Жоғары концентрация болған жағдайда (1 г/л-ден көп болса) майда ұнтақ түрінде ортаға қосады; ол үшін арнайы аппаратта стеринді өңдейді және ультрадыбыспен талқандайды.

  Микроорганизмдер көмегімен трансформациялау м/о-дің стериндерді көмірсу көзі ретінде пайдалану арқылы стериндердің ыдырауы нәтижесінде  түзілген өнімдердің шығуын жоғарылатуға негізделген.  Процесс ортаны оттекпен байыту арқылы ынталандырылады. Қоректік ортаға кейбір майларды (соялық, жержаңғақ, рапс, зәйтүн амйлары) жалпы массадан 1-3 % мөлшерінде қосу трансформация өнімінің шығуын жоғарылатады. Одан басқа жануар немесе өсімдік текті глицеридтерді (тристеарин, триолеин, трипальмитин) қосу дәл сондай нәтиже береді. Глицеридтердің ондай әсері микробиологиялық үрдістерде кеңінен қолданылатын ББЗ (твин) сияқты стериндердің гидрофобтық қасиетін жою механизміне негізделген. Стероидтардың микробиологиялық трансформациясы үрдісі кезінде басқа көпшілік микробиологиялық үрдістерде қолданылатын температура болуы қажет – 24-33⁰С. Ортаның рН жағдайы м/о штамына байланысты түрлі болып келеді.

  Трансформация аяқталғаннан кейін мицелийден (немесе басқа биомассадан) ажыратылған дақылдық сұйықтық стероид түріне байланысты таңдалатын органикалық еріткіш көмегімен (этилацетат, метиленхлорид н/е хлороформ) экстракцияланады. Судан бөлініп алынған экстрактты тазалайды (әдетте белсендірілген көмірмен өңдейді, сосын көмірді фильтрден өткізеді); содан соң оны вакуумда концентрлейді, алынған стероидтар тұнбасын қайта крисстализациялайды. Препаративті мақсатта аз мөлшердегі стероидтарды тазалауда бағаналы хроматография әдісін қолданады.

   Микробиологиялық трансформацияның спецификалық ерекшелігі – микроорганизмдердің таза культурасын пайдалану. Сондықтан технологиялық режимнің міндетті шарты – бөгде микрофлораның дамуына кедергі жасайтын шаралар қолдану.

  Трансформациялайтын культураны дайындау және өсіру операцияларын микробтық синтез өндірісіне арнайы қабылданған ережелерді қатаң сақтау арқылы  стерильді жағдайда жүзеге асырады. Алайда стероидты субстратты трансформацияға (қоректік ортада өсіп жатқан культураға) енгізу және трансформация үрдісінің өзі әдетте стерильді жағдайда емес жасала береді.  Ластану ықтималдылығын төмендету үшін стероидты субстрат  суспензиясын дайындауда стерильді суды пайдаланады, себебі стероидтың өзі автоклавтауға төзімсіз келеді. Бұл проблеманы шешу үшін қоректік ортаға трансформациялайтын культураны енгізбес бұрын, автоклавтаудан кейін орта температурасы 80⁰С-ге дейін төмендеген кезде (субстратқа қауіпсіз температура) стероидты субстратты енгізуге болады.  30 минуттан кейін стероид қосылған ортаны 33⁰С-ге салқындатады, сосын трансформациялайтын культураны енгізеді.

1.3.2 S затынан гидрокортизонды (кортизол) алу. Гидрокортизон – медицинада және ветеринарияда кеңінен қолданылатын қабынуға қарсы және антиаллергиялық препарат. Сонымен қатар ол метилпреднизолон, преднизолон, дексаметазон, триамцинолон сияқты  белсенділігі жоғары кортикостероидтар синтезінің бастапқы шикізаты болып табылады. Бұл технология C.lunata (қосымша В) микроорганизм культурасы арқылы жүзеге асады. 11β позициясына гидроксильді топты енгізуге жауапты фермент цитохром-p-450-монооксигеназалар (Cyt  p-450) тобына жатады. (Cyt  p-450) ферментінің ингибиторы – азольды фунгицид – кетоконазол болып саналады. С.lunata-дағы (Cyt  p-450) синтезіне жауапты геніне нүктелік мутация жасау арқылы азольды төзімділігін арттыруға болады. Алайда саңырауқұлақтардың мицелиальды формаларының мутациясы оның күрделі жасушалық қабықшасына және конидияларының көп ядролығына байланысты нәтижесіз болады. Бұл проблеманы шешу үшін бір ядролы протопласттар алынады. Лабораториялық зерттеулер нәтижесінде кетоконазолға төзімді Сurvularia lunata-ның жаңа штамы - Сurvularia lunata ВКМ f-644 алынды.                  Жалпы гидрокортизонды алу үрдісі төмендегі кезеңдерден тұрады:

 

1. Трансформациялаушы культураны өсіру кезеңі

1-генерацияның  2-генерацияның 3-генерацияның

лабор-лық инокуляты                    инокуляты      инокуляты

 Себінді материалды (микроорганизмдер культурасын) дайындау – кез келген биотехнологиялық процестің ең маңызды сатысының бірі. Микроорганизмдердің ферментерда дамуы мен антибиотиктің биосинтезі себінді материалдың сапасы мен мөлшеріне тікелей байланысты. Әдетте гидрокортизон продуцентінің ең жоғары физиологиялық белсенділігін тудыру үшін құрамында сахароза, ашытқы автолизаты және бейорганикалық тұздар қоспасы болатын бай табиғи қоректік орталарда өсіреді.Себінді материалды дайындау – көп сатылы үрдіс (1-сурет)

 

1-сурет. Көп сатылы себінді материалды дайындау схемасы. А – флакондарда өсіру, Б – шайқағыш колбаларда (Herold, 1957)

  1 – консервіленген бастапқы материал, 2 – қиғаш қатырылған агары бар пробиркада генерациялау,  3 – Ру ыдысында тығыз ортада ІІ стопорлы генерация, 3а, 3б – колбада сұйық ортадағы  І және ІІІ генерациясы, 4 – алдын-ала инокурлеу ферментері, 5 – инокурлеу ферментері, 6 – негізгі ферментер.

 Бұл жерде микроорганизмдерді өсіру үш кезекті қоректік орта генерациялау арқылы жүзеге асатынын көруге болады. Микроорганизмді алдымен пробиркада агарлы қоректік ортада өсіреді (2), сосын сұйық қоректік ортасы бар колбаға себінді жасайды да, шайқағыштарда тереңдік қабатта генерациялайды. Әр генерация 2-3 тәулік бойы жүреді (3а. 3б). Екінші генерациядан кіші инокуляторға (10 л) себінді жасалады, жақсы өсіп-дамыған культураны кейін үлкенірек инокуляторға (100-500 л) ауыстырады (5). Содан кейін пайда болған биомассаның 5-10%-ын (инокулят деп атайды) негізгі ферментерға тасымалдайды (6).

 Инокулятор қақпағын себінді жасар алдында формалин сулы ерітіндісімен өңдейді, аппарат және бөлмені бактерицидті лампамен сәулелендіреді және трансформациялық культураны өсірудің барлық процесін стерильді жағдайда жүргізеді. Содан кейін алынған трансформациялаушы культураны сепараторға жібереді, ол жерде судан бөлініп алынған мицелийлер негізгі реакция жүретін ферментерға тасымалданады.

   2. S затының трансформациясы да ферментерді және ауа фильтрін формалин ерітіндісімен стерилизациялаудан басталады. Стероидты ұнтақтап, стерильді суда 1 г/л мөлшерінде суспензияны жасауда аса сақ болу керек. Бөгде микрофлораның дамып кетпеуін қамтамасыз ету үшін антибиотикті қосады.

   3. Трансформация өнімін – гидрокортизонды бөліп алу кезеңі. Мицелиймен бірге дақылдық сұйықтық 2-кезеңнен кейін сепарацияға жіберіледі. Бөліп алынған мицелий дистилденген сумен шайылады. Мақсатты өнімді екі түрлі әдіспен бөліп алуға болады:

• Органикалық еріткіш көмегімен ферментациялық суспензияны экстракциялаудың дәстүрлі әдісі;
• Макрокеуекті ионогенсіз сорбентті кезекті органикалық еріткішпен десорбциялауды қолдану арқылы ферментациялық суспензияның сорбциясы.

Бастапқы субстратты 2,5-4 г/л мөлшерінде енгізген жағдайда: трансформация уақыты – 48-72 сағат; конверсия  – бастапқы кортексолондағы негізгі  зат мөлшерін ескере отырғанда 95%-дан кем емес. Гидрокортизон шығуы – техникалық сапалығы 60%-дан кем емес. [5]

 

Гидрокортизонның  преднизолонға трансформациялануы:

  M.globiforme трансформациялаушы культурамен жоғарыда айтылғандай аппараттарда, дәл сондай аэрация және араластырғыш қондырғылары бар жағдайда гидрокортизонның трансформациясын жүргізеді. Мақсатты өнім – преднизолонды дақылдық сұйықтықтан экстракция-сепарация әдісімен бөліп алады. [6] 

  Қазіргі кезде стероидтар алу технологиясында иммобилизденген микроорганизмдерді кеңінен қолданып келеді. Табиғатты көптеген микроорганизмдер бекіген, иммобилизацияланған жағдайда кездеседі: шырышқа батқан микроколония немесе тығыз субстратта буылтық түзеп биоқабыршық құрайды. Биотехнологияда иммобилизацияланған микроорганизмдерді пайдалану тиімді, себебі қажетті өнім алу үшін субстратты тұрақтандырады, белсенділігін ұзаққа созады, жылдам және толық мақсатты өнімді бөліп алуына және т.б көмектеседі. Ең алдымен инактивацияланған немесе тірі, стационарлық даму сатысындағы тыныштық күйіндегі клеткаларды қолданады. Биотехнологияда иммобилизацияланған микрорганизмдер арқылы органикалық заттарды биотрансформациялайды, аминқышқылдарының рацемиялық қоспаларын айырады, бірқатар күрделі эфирлердің гидролизін және т.б атқарады.

  Клеткаларды иммобилизациялау әдістері: адсорбция, ковалентті және көлденең байлау, түрлі полимерлерге енгізу әдістері, микрокапсулдеу. Полимерлерге, әсіресе целлюлозалы талшықтарға енгізу технологиясына қазіргі кезде аса көңіл бөлінеді. Ал экономикалық жағынан ең тиімді болып каппа-каррагинин деп аталатын Rhodohyceae, Ginartinaceae балдырларынан алынатын полисахарид саналады. Гельге енгізілген интактты жасушалар қоректік ортада белсенді түрде көбейеді және полиферментті жүйе ретінде бірнеше мәрте қолданыла алады. [7]

  Стероидты қосылыстарды иммобилизденген клеткалардан алу өте қолайлы. Дәл осы стероидты субстраттарды ең алғаш рет иммобилизденген жасушалар арқылы трансформациялауға қол жеткізді. Ресейде микроорганизмдердің иммобилизденген жасушалары көмегімен мынандай стероидтар трансформация үрдістері жасаланады: 1,2-дегидрлеу, 1,2-қайта түзу, 20-қайта түзу (Arthobacter globiforme), стереоспецификалық 17β-қайта түзу (Saccahromyces cerevisae), 20α- және 20β-қайта түзу (B.megateruim), 11α- және 11β-гидроксилдеу (Tieghemella orchidis).