Питер Митчелл. Нобелевский лауреат по химии 1978 года

В присутствии  кислорода два электрона в  молекуле NADН стремятся перейти  к молекуле кислорода, и такой  переход сопровождается освобождением  энергии. Восстановленная форма NADН  устойчива и без ферментов  не окисляется кислородом. "Водород" (два электрона и протон) в молекуле NADН так же химически устойчив, как химически инертен газообразный водород (Н₂) в смеси с газообразным кислородом (О₂). Такая смесь, однако, известна под названием "гремучий газ", и достаточно искры, чтобы произошел взрыв - мгновенное образование воды, сопровождающееся огромным выделением энергии в виде тепла. Задача, стоящая перед ферментами дыхательной цепи, такова: необходимо провести взрыв так, чтобы освобождающаяся энергия была запасена в форме, пригодной для совершения работы - синтеза АТФ. Уместно подчеркнуть, что ферменты дыхательной цепи замечательны не столько тем, что они, как и всякие другие катализаторы, увеличивают скорость химической реакции (многие окислительно-восстановительные реакции мгновенно протекают в водных растворах и без ферментов), сколько тем, что они упорядоченно переносят электроны от одного компонента к другому (в конечном счете на кислород), постепенно понижая потенциал "водорода" и запасая энергию.

Проследим теперь путь двух электронов от NADН  к кислороду, оставляя пока в стороне  энергетику этого процесса. Суммарный  процесс разбит на три стадии, каждая из которых катализируется тремя  липопротеидными комплексами, встроенными  во внутреннюю мембрану митохондрий. Каждый комплекс (I, III и IV) представляет собой  весьма крупное образование, построенное  из многих полипептидных цепей. Комплекс I, например, состоит из более чем 40 таких цепей (субъединиц) и имеет  молекулярную массу около 1 млн. Комплексы плавают в фосфолипидном море мембраны, так что верхушки и дно этих айсбергов контактируют с водными фазами матрикса и межмембранного пространства митохондрий. Жидкая липидная фаза разрешает двумерную диффузию комплексов в плоскости мембраны, так что комплексы могут встречаться между собой. Каждый комплекс катализирует окислительно-восстановительную реакцию - перенос электронов и, следовательно, как уже отмечалось, содержит в своем составе простетические группы, способные принимать и отдавать электроны. Эти группы представлены разнообразным набором химических структур. Комплекс I содержит в своем составе флавин (производное витамина рибофлавина) и более 20 атомов железа, упакованных в клетки, построенные из атомов серы. Комплекс III содержит железо как в серных клетках, так и в виде комплексов с порфиринами - сложными гетероциклическими молекулами, содержащими четыре атома азота. Такие комплексы называются гемами, а комплексы гемов с полипептидными цепями - цитохромами. В состав комплекса IV (дыхательный фермент Варбурга, цитохромоксидаза) помимо двух различных гемов входят несколько атомов меди, прочно связанных с белком. Кроме этих трех гигантских образований в состав дыхательной цепи входят еще два компонента. Один из них - небольшой белок (молекулярная масса около 13 тыс.), содержащий ковалентно связанный гем - цитохром с. Другой - нерастворимое в воде "жирное" соединение - убихинон, способное выполнять в гидрофобной фазе мембраны такую же функцию, какую выполняет NAD в водном окружении цитоплазмы или матрикса митохондрий.

Убихинон (как окисленный, так и восстановленный) совершенно нерастворим в воде, но хорошо растворяется в средах с низкой диэлектрической постоянной ("жирные" среды). Длинный хвост убихинона, по-видимому, вытянут в плоскости  гидрофобного слоя мембраны, а активная голова может располагаться либо в той же плоскости, либо приближаться к поверхностям мембраны, контактирующим с водными фазами. Важное свойство убихинона, которое понадобится  нам при дальнейшем рассмотрении, состоит в том, что его голова может восстанавливаться ступенчато, принимая последовательно по одному электрону (и протону). При этом возникает  полувосстановленная форма – убисемихинон.

Первая  стадия окисления NADН катализируется комплексом I, один активный центр которого контактирует с водной фазой матрикса (внутреннее пространство митохондрий) и связывает NADH. Два электрона, отщепленные от NADН, путешествуют по окислительно-восстановительным компонентам комплекса I и в конечном счете попадают на убихинон, который связывается с другим активным центром, расположенным внутри гидрофобной фазы мембраны. В результате происходит реакция

NADH + H⁺ + Убихинон →NAD⁺ + Убихинол,

в ходе которой электроны из водного  окружения (в молекуле NADН) попадают в "жирную" фазу мембраны (молекула убихинола). Энергетический потенциал (запас энергии) атомов водорода (Н⁺ ) в молекуле убихинола существенно ниже, чем в молекуле NADН, и в результате реакции освобождается энергия. Если бы такой процесс проходил в гомогенном растворе (независимо от того, катализировался бы он комплексом I или спонтанно), то энергия выделилась бы в виде тепла. На самом деле энергия реакции запасается, но об этом позже.

Восстановленный убихинон (убихинол) отдает электроны  из гидрофобной фазы в водное окружение - на атом железа гема цитохрома с. Этот процесс катализируется комплексом III (при этом электроны путешествуют по атомам железа в составе компонентов комплекса):

Убихинол + 2 цитохром с(железо окислено)→Убихинон +2 цитохром с(железо восстановлено) +2Н⁺

Энергетический  потенциал электронов (теперь в цитохроме  с) становится еще ниже. Окисленный цитохром с хорошо связывается с  комплексом III, а восстановленный - с комплексом IV. Это означает, что комплексы III и IV умеют различать белковые молекулы окисленного и восстановленного цитохрома с (молекулярная масса около 13 тыс.), отличающиеся друг от друга всего на один электрон, - яркий пример того, что связывание малого по размеру лиганда (в данном случае электрона) способно приводить к изменению конформации белка.

Последняя стадия (теперь в реакцию дыхания  вступает собственно кислород) катализируется комплексом IV:

4 цитохром  с + О₂ + 4Н⁺ → 4 цитохром с + Н₂О,

(железо  восстановлено)       (железо окислено)

и электроны, пройдя по атомам железа и меди в  составе комплекса IV, попадают, наконец, на кислород, связывающийся в активном центре цитохромоксидазы, что приводит к образованию воды.

Суммарная реакция, катализируемая дыхательной  цепью, таким образом состоит  в окислении NADH кислородом, приводящем к образованию Н2О. Энергетический потенциал электронов в NADH, который по запасу энергии существенно больше, чем даже в молекуле водорода, оказывается плавно спущенным до стабильного состояния в молекуле воды. При этом освобождается энергия, достаточная для синтеза по крайней мере трех молекул АТР на каждую пару электронов, перенесенных от NADH к кислороду. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

ХЕМИОСМОТИЧЕСКИЙ  МЕХАНИЗМ ЗАПАСАНИЯ  ЭНЕРГИИ ДЫХАНИЯ 

При рассмотрении окислительно-восстановительных реакций (собственно обмен электронами) в уравнениях, описывающих эти реакции, постоянно фигурировала другая заряженная частица - ион водорода, протон (Н⁺). Этот знаменательный факт, как оказалось, имеет принципиальное значение для понимания сопряжения между окислительно-восстановительными реакциями и запасанием освобождающейся при этом энергии. На возможность создавать высокие концентрации ионов Н⁺ в клетках при протекании реакции окисления впервые, по-видимому, обратили внимание в 50-х годах Р. Дэвис (R. Davies), А. Огстон (A. Ogston) и Ю. Конвей (E. Konway) при обсуждении вопроса о механизме секреции кислоты клетками желудка. Если представить себе, что реакции, о которых шла речь, протекают так, что электроны удаляются из раствора, окисление любой органической молекулы приведет к появлению в этом растворе ионов водорода (рН раствора понизится, повысится кислотность раствора). П. Митчелл в 1961 году предложил идею хемиосмотического энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Пожалуй, наиболее существенны для понимания принципа хемиосмотического сопряжения следующие положения:

1. Внутренняя  мембрана митохондрий, где происходят  окислительно-восстановительные реакции  дыхания, непроницаема для ионов  водорода (Н+) (точнее, протон диффундирует  через двойной фосфолипидный  слой очень медленно по сравнению  со скоростью потребления кислорода). В то же время мембраны хорошо  проницаемы для воды и благодаря  электролитической диссоциации  Н₂О→ Н⁺ + ОН⁻ запас протонов в водных растворах неограничен.

2. Внутренняя  мембрана митохондрий асимметрична: одни компоненты дыхательной  цепи контактируют с матриксом  (например, активный центр комплекса  I), другие расположены внутри  мембраны (например, убихинон), третьи  контактируют с межмембранным  пространством (например, цитохром с).

3. Разрушение  мембраны не препятствует окислению  NADH кислородом, а даже ускоряет  дыхание. Энергетическое сопряжение (синтез АТФ) при этом полностью  прекращается: происходит разобщение  процессов переноса электронов  и запасания энергии. Для разобщения  необязательно полностью разрушать  мембрану - достаточно, сохраняя ее  структуру, добавить вещества, резко  повышающие проницаемость мембраны  для протона. 

Для того чтобы понять принцип хемиосмотического  сопряжения, предложенный Митчеллом, воспользуемся  рассмотрением химического генератора электричества, применяющегося в технике. Представим себе сосуд, разделенный  перегородкой, проницаемой для воды и непроницаемой для каких  бы то ни было ионов. В перегородку  вмонтирован проводник электричества - металл (М), торцовые поверхности которого, обращенные одна в левый, а другая в правый отсек сосуда, покрыты  каким-нибудь химическим катализатором (мелко диспергированная платина, никель). Осуществим теперь подачу к левой  поверхности металлического проводника водорода (Н₂), а к правой кислорода (О₂). Ситуация аналогична той, которая создается в гремучем газе (смеси кислорода и водорода), однако между реагирующими молекулами возможен только электронный контакт (за счет металлического проводника

Суммарный процесс такого контролируемого  окисления водорода кислородом (образование  воды) приведет к тому, что перегородка  окажется электрически заряженной (два  отрицательных заряда слева перенесены направо) и возникнет разница  концентраций ионов водорода в обоих  отсеках ячейки: слева появится кислота (Н⁺), а справа - щелочь (ОН⁻).

Первый  член правой части равенства, описывающего энергетический баланс реакции (DY), - электрическая  составляющая запасенной энергии, второй - осмотическая. Очевидно, что, после  того как перегородка зарядится (слева +, справа -), процесс прекратится - электроны не побегут по проводнику против электрического поля. Если заряд  на перегородке снимать (подключить устройство, потребляющее электрическую  энергию, например лампочку), то окисление  продолжится, а горение лампочки будет сопровождаться накоплением  кислоты слева и щелочи справа. Можно расходовать запасенную энергию  и по-другому: устроить в перегородке  каналы для протонов. В этом случае за счет тока протонов слева направо  также можно будет совершать  работу. Именно так (за счет тока протонов) устроена молекулярная машина, синтезирующая АТФ.

Повтиримся: поскольку H⁺ — химические частицы, несущие положительный заряд, неравномерное их накопление по обе стороны мембраны приводит к возникновению не только химического (концентрационного) градиента этих частиц, но и ориентированного поперек мембраны электрического поля (суммарный положительный заряд, где происходит накопление H⁺, и отрицательный заряд по другую сторону мембраны). Таким образом, при переносе электронов на ЦПМ возникает трансмембранный электрохимический градиент ионов водорода, обозначаемый символом DmH+, и измеряемый в вольтах (В, мВ), который состоит из электрического (трансмембранная разность электрических потенциалов Dy) и химического (концентрационного) компонентов (градиент концентраций H⁺ — D pH). Измерения показали, что на сопрягающих мембранах прокариот при работе дыхательных и фотосинтетических электронтранспортных цепей DmH+ достигает 200–250 мВ, при этом вклад каждого компонента непостоянен. Он зависит от физиологических особенностей организма и условий его культивирования.

Итак, в  соответствии с хемиосмотической теорией  П. Митчелла, энергия, освобождаемая  в результате работы; электронтранспортной цепи, первоначально накапливается  в форме трансмембранного градиента  ионов водорода. Разрядка образующегося DmH⁺ происходит с участием локализованного в той же мембране протонного АТФ-синтазного комплекса: Н+ возвращаются по градиенту DmH⁺ через Н⁺–АТФ-синтазу, при этом без возникновения каких-либо промежуточных высокоэнергетических соединений из АДФ и неорганического фосфата образуется АТФ (рис. 1).

Рис. 1. Схема  переноса электронов и протонов по электронтранспортной цепи и протонной  АТФ-синтазы: АНг и В — донор  и акцептор электронов соответственно;

1, 2, 3 —компоненты электронтранспортной цепи. Объяснения см. в тексте

Сами  сопрягающие мембраны в интактном  состоянии непроницаемы для ионов, особенно Н⁺ и ОН[– ). Предположительно, для синтеза одной молекулы АТФ достаточен перенос двух протонов, т. е. Н⁺/АТФ=2. Однако не исключено, что Н⁺/АТФ может быть больше.

Локализованная  в мембране H⁺–АТФ-синтаза катализирует реакции синтеза и гидролиза АТФ в соответствии с уравнением:

АДФ + ФН + nHНАР+→АТФ + H₂O + nHВНУТР+

Реакция, протекающая слева направо, сопряжена  с транспортом H⁺ по градиенту DmH⁺, что приводит к его разрядке и синтезу АТФ. Протекающая в противоположном направлении реакция гидролиза АТФ, сопровождающаяся переносом Н⁺ против градиента, приводит к образованию (или возрастанию) DmH⁺ на мембране. Таким образом, АТФ-синтазный ферментный комплекс служит механизмом, обеспечивающим взаимное превращение двух форм клеточной энергии (DmH⁺ →АТФ), устройством, сопрягающим процессы окислительной природы с фосфорилированием.