Основы хроматографических методов анализа

Неподвижная фаза. В принципе в тонкослойной хроматографии можно использовать все неподвижные фазы, применяемые в колоночной хроматографии. Наиболее широко в ТСХ используют силикагель и оксид алюминия. Силикагель обладает высокой емкостью, инертен по отношению к наиболее неустойчивым веществам, доступен. Адсорбенты для тонкослойной хроматографии получают в виде частиц размером 1—40 мкм. Для большинства аналитических разделений рекомендуют применять частицы размером 10—15 мкм. Толщина слоя адсорбента, нанесенного на пластинку, составляет 100—300 мкм.

Силикагели  разных партий имеют различные свойства: рН поверхности, распределение пор  по размерам и удельную поверхность. Для ТСХ используют крупнопористые силикагели с удельной поверхностью 30—600 м²/г и диаметром пор 0,01 — 0,02 мкм. Они обладают полукристаллической структурой и относительно однородной поверхностью (4—5 гидроксильных групп на 0,01 мкм поверхности). Присутствием этих поверхностных гидроксильных групп можно объяснить селективные адсорбционные свойства силикагеля. Силикагель адсорбирует ненасыщенные, ароматические или полярные молекулы благодаря образованию водородных связей. При этом хроматографические свойства силикагеля изменяются в широком диапазоне в зависимости от метода его получения и термической обработки. Для получения; воспроизводимых результатов следует знать диаметр пор и свойства поверхности силикагеля, а также стандартизировать его свойства.

Выпускаемые для тонкослойной хроматографии  адсорбенты могут содержать добавки связующего (5—20% гипса или 2— 5% крахмала), а также добавки флуоресцентного индикатора.

После силикагеля большое значение в ТСХ имеет  оксид алюминия, на незакрепленном слое которого чаще всего проводят разделение примесей. В нашей стране и за рубежом выпускают несколько марок этого адсорбента (оксид алюминия кислый, нейтральный, основной с добавками и без них).

Реже в  тонкослойной хроматографии используют такие адсорбенты, как диатомитовая земля (кизельгур G, целит 545) силикат магния и другие неорганические адсорбенты — измельченное пористое стекло, ионообменные смолы, а также органические сорбенты, например полиамиды, сефадексы, полиэтиленовый порошок под названием гостален S и др.

Углеродные  адсорбенты обладают отличными адсорбционными свойствами, но цвет исключает их применение в тонкослойной хроматографии из-за трудности детектирования. Многие зарубежные фирмы выпускают готовые пластинки из стекла или фольги с нанесенным на них слоем сорбента. В монографиях  подробно описаны сорбенты для ТСХ и перечислены фирмы, выпускающие их, а также готовые для использования хроматографические пластинки. Возможно использование модифицированных адсорбентов. Так, поверхности адсорбента может быть придана гидрофобность путем пропитки его минеральными маслами, жидкими парафинами, силиконовыми маслами. Модифицированная гидрофильная поверхность может быть получена при обработке пластинок с силикагелем   формамидом,   диметилформамидом,      гликолями, различными буферными растворами.

В семидесятых  годах качество адсорбентов для тонкослойной хроматографии значительно улучшилось, появились теоретические работы по хроматографическому поведению растворителей, усовершенствовались способы нанесения пробы на слой сорбента. Появился новый перспективный метод высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ). В этом методе используемый адсорбент (силикагель) отличается высокой дисперсностью (поры 0,006 мкм), обладает лучшими разделяющими и оптическими свойствами, чем обычные силикагели. На слоях адсорбента растворитель движется медленнее, поэтому для уменьшения длительности элюирования берут пластинки небольших размеров. Проба должна быть небольшой, так как иначе пластинка перегружается: если проба превышает 10 мкг, разделения достичь не удается. Объем наносимой пробы во избежание растекания пятен должен быть менее 1 мкл, а диаметр наносимых пятен проб должен быть минимальным (<2 мм). Для нанесения проб используют микрошприц с микрометрическим винтом либо специальный платино-иридиевый капилляр. В остальном в этом методе используют все приемы макро-ТСХ.

        Подвижная фаза. При выборе элюента для проявления хроматограмм исходят из элюирующей силы растворителей, которые в порядке возрастания этого свойства образуют элюотротшый ряд. Для всех полярных соединений порядок изменения элюирующей силы примерно одинаков. Одним из способов выбора подвижной фазы является проведение так называемого пробного хроматографирования. Для этого два покровных стекла, сложенных вместе, помещают в суспензию адсорбента, например силикагеля в смеси хлороформ — метанол. Затем стекла извлекают, разделяют, высушивают, наносят на них 2 мкл 1%-ного раствора испытуемого образца и проявляют в растворителе с низкой элюирующей силой. После испарения растворителя пластинку помещают в камеру с парами иода для обнаружения исследуемых соединений.

Опыт повторяют  несколько раз с растворителями возрастающей элюирующей силы до тех  пор, пока значения Rf для исследуемых соединений не станут равным 0,3—0,8. Помимо соответствующей элюирующей силы подвижная фаза должна быть достаточно летучей и свободной от примесей.

Анализируемую пробу (2—10 мкл) наносят на пластинку  в летучем растворителе на расстоянии 1,5 см от края пластинки. Растворитель должен быть неполярным, чтобы уменьшить размывание пятна на точке старта. Он также должен быть низкокипящим, так как до начала проявления должен испариться с пластинки. Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру, содержащую соответствующую жидкую подвижную фазу, которая под действием капиллярных сил перемещается по слою адсорбента. При этом компоненты исследуемой смеси продвигаются через слой с различными скоростями, зависящими от адсорбционных коэффициентов компонентов смеси. После проявления пластинку из камеры извлекают и испаряют подвижную фазу. Положение разделенных зон на хроматограмме, если они не окрашены, определяют при наблюдении в УФ-свете или после опрыскивания ее подходящими реагентами. Положение исследуемых веществ на хроматограмме определяют, измеряя Rf:

Rf  всех адсорбированных веществ меньше1.

Другим способом, определяющим положение пятна на хроматограмме, является отнесение его к положению вещества сравнения х («свидетеля»).

 

 

Положение исследуемого вещества R_x тогда выражается следующим отношением:

В отличие от Rf значения R_x могут быть больше 1.

На воспроизводимость значений Rf влияют качество и активность адсорбента, толщина слоя адсорбента, чистота подвижной фазы и насыщение ее паров в камере, температура окружающего воздуха, глубина слоя подвижной фазы и ее скорость, размер пробы, а также точность измерения центра пятна.

           Коэффициент разделения компонентов. Схема ТСХ и экспериментально определяемые величины, которые характеризуют этот процесс, приведены на рис. 4.1.

Сорбционные свойства системы в  ТСХ характеризуются подвижностью R_f, которая рассчитывается из экспериментальных данных (рис. 4.1) по уравнению

где — расстояние от стартовой линии до центра зоны: — расстояние, пройденное за это же время растворителем.

Строго говоря, при определении  подвижности вместо расстояний х и x_f следовало бы учитывать скорость движения соответствующих веществ в тонком слое, так как в теории ТСХ принято считать, что скорость движения центра зоны хроматографируемого вещества составляет строго определенную долю скорости движения растворителя. Однако измерение этих величин затруднительно, а значения R_f , рассчитанные по соотношению, также характеризуют подвижность. По смысловому определению R_f как свойство, характерное для данной системы, не должно зависеть от концентрации и других факторов. Опыт показывает, однако, что воспроизводимость и постоянство значений R_f не всегда достаточны, особенно при анализе неорганических ионов. На R_f влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителя и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. На практике часто пользуются относительной величиной где R также рассчитывается по уравнению:

     

Стандартное вещество (свидетель) в  том же растворителе наносится на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях. Число теоретических тарелок n в методе ТСХ рассчитывается по соотношению:

Значения  и   определяются в соответствии с рис.4.1. Тогда высота Н, эквивалентная теоретической тарелке, будет равна:

Коэффициент разделения в тонком слое K_f связан с числом теоретических тарелок и подвижностями R_f уравнением

где R      , R       — подвижности соседних компонентов смеси.

Теоретический анализ показывает, что при небольших значениях R_f и уменьшении длительности анализа размывание зоны вещества на сорбенте бывает максимальным, следовательно, концентрация вещества будет максимальна и чувствительность анализа увеличится. Уменьшение диаметра зерна в тонком слое приводит к увеличению продолжительности анализа и усиливает диффузное размывание.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 4.1. ТСХ – схема:

a-а – стартовая линия;

b-b –граница фронта растворителя в конце опыта;

заштрихованные пятна  характеризуют положение компонентов  в тонком слое в конце опыта.

По окончании хроматографирования  зоны на хроматограмме проявляют  химическим или физическим способом. При химическом способе пластинку опрыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентом смеси. При обработке, например, парами иода четко проявляются непредельные соединения. В физических способах проявления используется способность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения, часто при добавлении флуоресцирующего индикатора, взаимодействующего с компонентами смеси. Вещества, обладающие радиоактивным излучением, обнаруживаются методом радиоавтографии с помощью различных фотоматериалов (бумаги или пленки). После проявления хроматограммы приступают к идентификации веществ и дальнейшему анализу.

5.Особенности  анализа загрязнений воздуха  методом тонкослойной хроматографии

Анализ загрязнений воздуха  методом тонкослойной хроматографии  включает отбор проб из воздуха и последующий анализ на тонком слое адсорбента. Отбор проб осуществляют в жидкие поглотительные среды, на твердые сорбенты и различные фильтрующие материалы. Специфика анализа примесей методом ТСХ позволяет непосредственно анализировать лишь малолетучие соединения. Для определения в воздухе легколетучих веществ их необходимо предварительно переводить в нелетучие производные, которые можно разделять на пластинке с помощью обычной ТСХ-техники.

Для определения токсичных  примесей малолетучих соединений (например, сложных эфиров фталевых кислот, высокомолекулярных спиртов, ПАУ, пестицидов или полихлорбифенилов) анализируемый воздух можно пропускать над частью пластинки, покрытой слоем активного адсорбента. Сконцентрированные таким  способом примеси далее разделяют идетектируют на этой же пластинке на слое силикагель — гипс, который был изолирован от потока воздуха в момент отбора пробы. Это позволяет избежать потерь исследуемых примесей, связанных с десорбцией их из концентратора. Аналогичным способом можно анализировать ПАУ, пропуская воздух через керамический фильтр, вмонтированный в пластинку.

Уникальной особенностью анализа методом ТСХ является возможность использования многократного  проявления, что позволяет концентрировать  исследуемые пробы при низких значениях Rf.

Проявление  хроматограмм. Хроматограммы проявляют обычно методом восходящей хроматографии в закрытых камерах, размеры которых несколько превышают размеры пластинок. Более сложной является сэндвич-камера (с-камера), в которой покровная пластинка вместе с пластинкой, на которую нанесен адсорбент, образует небольшую внутреннюю камеру, что способствует хорошему ее насыщению. При использовании с-камеры пятна разделенных веществ меньше, а краевой эффект отсутствует. Другие методы проявления, описанные ниже, используют реже из-за большой затраты времени и сложности применения в практических условиях, что умаляет основное достоинство метода тонкослойной хроматографии — его простоту.

  Нисходящее проявление по разрешающей способности и длительности проявления не имеет никаких преимуществ перед восходящим проявлением.

Круговое проявление используют для быстрого подбора  подвижной фазы. В этом случае подвижную  фазу вводят в центр пятна. При  этом компоненты исследуемого образца  перемещаются к краям пластинки в виде концентрических колец.

Горизонтальное проявление проводят в приборе, известном под  названием «горизонтальная BN-камера».

  Непрерывное проявление позволяет улучшить разрешение медленно перемещающихся разделяемых веществ, так как при таком способе проявления отсутствует распознаваемый фронт растворителя. Одновременно с образцом следует хроматографировать вещество сравнения х и определять R_x.

  Многократное проявление дает возможность проявить пластинку несколько раз в одном и том же растворителе, причем перед каждым очередным проявлением ее высушивают. Этот метод пригоден для медленно передвигающихся и плохо разделяемых соединений. Значение R_f в этом случае,, обозначенное Rf, можно получить из значения R_f после одного проявления (¹Rf), используя выражение

где n — число проявлений.

 

Ступенчатое проявление используют для разделения смесей различной полярности.

Двумерное проявление используют для исследования сложных смесей. В этом случае исследуемый образец, нанесенный на пластинку, проявляется сначала обычным способом, а затем пластинку поворачивают под углом 90° и проявляют с другой подвижной фазой. Так, с помощью двумерной хроматографии проведено разделение алифатических и ароматических аминов на силикагеле F254. Приведены значения Rf для 28 аминов в различных системах растворителей. При этом ароматические амины имеют Rf —0,70, алифатические — от О до 0,50. Разделение компонентов внутри каждой группы осуществляли методом двумерной ТСХ. Ароматические амины разделяли в тройной подвижной фазе: толуол — пиридин — хлороформ (8:1:1) и толуол — пиридин — пропанол (8:1:1), алифатические — в смеси метанол—1%-ная уксусная кислота (4:1)   и пропанол — 1%-ная уксусная кислота   (4:1).