Основы хроматографических методов анализа

По способу  относительного перемещения фаз различают фронтальную проявительную, или элюэнтную, и вытеснительную хроматографию.

Фронтальный метод. Это простейший по методике вариант хроматографии. Он состоит в том, что через колонку с адсорбентом непрерывно пропускают анализируемую смесь, например, компонентов А и В в растворителе Solv. В растворе, вытекающем из колонки, определяют концентрацию каждого компонента и строят график в координатах концентрация вещества—объем раствора, прошедшего через колонку. Эту зависимость обычно и называют хроматограммой или выходной кривой (рис. 2.1).

Вследствие  сорбции веществ А и В сначала  из колонки будет вытекать растворитель Solv, затем растворитель и менее сорбирующийся компонент А, а затем и компонент В и, таким образом, через некоторое время состав раствора при прохождении через колонку меняться не будет. Фронтальный метод используется сравнительно редко. Он применяется, например, для очистки раствора от примесей, если они сорбируются существенно лучше, чем основной компонент, или для выявления из смеси наиболее слабо сорбирующегося вещества.

Проявительный (элюэнтный) метод. При работе по этому методу в колонку вводят анализируемую смесь, содержащую компоненты А и В в виде порции раствора или газа и колонку непрерывно промывают газом-носителем или растворителем Solv. При этом компоненты анализируемой смеси разделяются на зоны: хорошо сорбирующееся вещество В занимает верхнюю часть колонки, а менее сорбирующийся компонент А будет занимать нижнюю часть. Типичная выходная кривая изображена на рис. 2.2.

В газе или  растворе, вытекающем из колонки, сначала  появляется компонент А, далее — чистый растворитель, а затем компонент В.

Рис. 2.1. Выходная кривая             Рис. 2.2. Выходная кривая проявительного анализа

       фронтального  анализа

  Чем больше концентрация компонента, тем выше пик и больше его площадь, что составляет основу количественного хроматографического анализа. Проявительный метод дает возможность разделять сложные смеси, он наиболее часто применяется в практике. Недостатком метода является уменьшение концентрации выходящих растворов за счет разбавления растворителем (газом-носителем).

Вытеснительный метод. В этом методе анализируемую смесь компонентов А и В в растворителе Solv вводят в колонку и промывают раствором вещества D (вытеснитель), которое сорбируется лучше, чем любой из компонентов анализируемой смеси. Концентрация раствора при хроматографировании не уменьшается в отличие от проявительного метода. Существенным недостатком вытеснительного метода является частое наложение зоны одного вещества на зону другого, поскольку зоны компонентов в этом методе не разделены зоной растворителя.

3. Качественный и количественный анализ

Проще всего идентификация  вещества может быть сделана, если пятно  определяемого вещества имеет характерную окраску или определяемое вещество образует на хроматограмме окрашенное пятно под действием специального реактива. Однако число таких веществ, особенно органических, невелико, поэтому метод имеет ограниченное применение.

Наиболее общий подход к качественному анализу основан на значениях R_f. Хроматографическая подвижность является чувствительной характеристикой вещества, однако, она существенно зависит от условий определения. Эта трудность преодолевается путем проведения опыта в строго фиксированных стандартных условиях, которые регламентируют размер пластин, толщину слоя сорбента, объем пробы, длину пути фронта растворителя и другие факторы. При соблюдении стандартных условий получаются воспроизводимые значения R_f, которые можно использовать в аналитических целях при сравнении с табличными, если они получены в тех же условиях опыта.

Самым надежным является метод свидетелей, когда на стартовую  линию рядом с пробой наносятся  индивидуальные вещества, соответствующие  предполагаемым компонентам смеси. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым, поэтому совпадение R_f компонента пробы и одного из свидетелей дает основания для отождествления веществ с учетом возможных наложений. Несовпадение R_f интерпретируется более однозначно: оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего компонента.

Интересные результаты получаются при сочетании ТСХ  с другими методами. При сочетании  ТСХ с газовой хроматографией пластинка становится своеобразным детектором. Выходящий из колонки  газ направляется на стартовую линию пластинки и затем хроматографируется по методике ТСХ выбранным растворителем. Анализ тонкослойных хроматограмм позволяет независимым методом идентифицировать компоненты смеси, что увеличивает надежность анализа. Хроматографирование вещества методом ТСХ после прохождения газовой колонки может дать дополнительную информацию о составе смеси, в частности о компонентах, разделение которых методом газовой хроматографии было неполным. Сочетание ТСХ и газовой хроматографии позволяет также установить, все ли компоненты смеси вымываются из колонки, происходят ли химические изменения при хроматографировании, и решить некоторые другие вопросы.

Сочетание ТСХ с электрофорезом расширяет возможности разделения, в частности, неорганических ионов  и значительно ускоряет процесс разделения. ТСХ комбинируется также с экстракцией и другими методами анализа.

Количественные определения  в ТСХ могут быть сделаны или  непосредственно на пластинке, или  после удаления вещества с пластинки. При непосредственном определении  на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному графику находят количество вещества.

Применяют также прямое спектрофотометрирование пластинки  с помощью спектроденситометров. Для количественных расчетов также предварительно строят градуировочный график, используя оптическую плотность в центре пятна.

Наиболее точным считается  метод, в котором вещество после  разделения удаляется с пластинки  и анализируется спектрофотометрическим или иным методом. Удаление вещества с пластинки обычно производят механическим путем, хотя иногда применяют вымывание подходящим растворителем.

На результаты количественного определения большое  влияние оказывает техника нанесения пробы на тонкий слой адсорбента, которая выполняется с помощью микрошприца или калиброванной микропипетки с оттянутым концом. Одной из причин ошибок является втягивание пробы обратно в кончик иглы шприца. Для нанесения пробы на пластинку необходимо использовать по возможности иглу с тонким концом, а также смазывать ее силиконом.

Ошибка зависит  и от природы адсорбента. Так, для  силикагеля она может составлять 6,8%, для полиэтиленаминцеллюлозы—13,7%. При нанесении пробы важно не нарушить, слоя адсорбента, так как это приводит к искажению формы пятна. При этом элюирование важно проводить в одинаковых условиях и одним и тем же растворителем, чтобы избежать незначительных изменений условий, которые могут оказать влияние на результаты, Оптимальным растворителем для количественного определения считают однокомпонентный растворитель со значениями Rf исследуемого соединения от 0,25 до 0,75.

Вопросы теории количественной тонкослойной хроматографии освещены в монографиях. В 1954 г. Кирхнер и др. первыми применили ТСХ для количественного анализа. Эти авторы показали, что тонкослойную хроматографию можно использовать как аналитический метод, и если условия анализа тщательно стандартизированы, то надежность метода достаточно велика.

При проведении прямого количественного анализа  следует руководствоваться следующими рекомендациями:

1. На пластинку должны быть нанесены одинаковые объемы проб и стандартов.
2. Для приготовления проб и стандартов необходимо пользоваться одним растворителем.
3. Пробы и стандарты следует хроматографировать на одной пластинке во избежание ошибок, связанных с изменением в толщине слоя.
4. Концентрации исследуемых образцов и стандартов должны быть близкими. Наиболее точные результаты получают на количествах пробы, которые соответствуют нижнему пределу обнаружения.
5. Расстояние, пройденное стандартами и образцами, должно быть идентичным.

Для полуколичественного  определения может быть применен метод визуального сравнения. Это быстрый метод; не требует специального оборудования; точность его ±20%. Количественный анализ по площади пятна более трудоемок, однако он объективнее и позволяет получать результаты измерения площади пятна с точностью 5—10%. Площади пятен измеряют планиметром, взвешивают копии пятен на кальке или на фотографии. Главным источником ошибок является определение границ пятна. Количество вещества в пятнах находят по зависимости массы вещества от площади пятна, найденного для стандартных растворов.

При количественном анализе методом денситометрии  измеряют интенсивность окраски пятна. Метод включает сканирование хроматограммы в проходящем или отраженном свете, который затем попадает в фотоумножитель. Разность в интенсивности падающего и проходящего или отраженного света в виде электрического сигнала регистрируется на графике. Высота пика является мерой интенсивности пятна. Соотношение между площадью пика и массой вещества в пятне получают, например, умножением высоты пика на его ширину, измеренную на половине высоты, или используя интегратор. При использовании денситометрии точность измерения площади пятна может составлять 2—5%,

После извлечения исследуемых  веществ с адсорбента можно проводить их количественный анализ другим методом, например, с помощью спектрофотометрии. Такие исследования могут проводиться также с целью идентификации анализируемых примесей или дальнейшего разделения веществ (газовая хроматография) для более детальной интерпретации состава пробы.

Для спектрофотометрического  анализа вещество вымывают соответствующим растворителем, добавляют, если нужно, окрашивающий реагент и проводят измерение. Ошибки определения вызываются главным образом загрязнением исследуемых проб, растворителя и адсорбента, неполным извлечением анализируемых соединений. Так как примеси поглощают в основном в УФ-области спектра, определение исследуемых веществ лучше проводить в видимой части спектра. Пределы обнаружения исследуемых соединений с применением оптических методов детектирования зависят от ряда факторов, в том числе и от природы соединений, и изменяются в широких пределах. Так, при измерении флуоресценции минимально определяемые количества веществ составляют 0,05—10 мкг. Анализ сложной смеси может потребовать повторного разделения. В этом случае первой ступенью является грубое фракционирование соединений пробы с различными функциональными группами методом адсорбционной хроматографии в тонком слое. Затем разделенные зоны вещества, соскабливают, удаляют с адсорбента и разделяют методами газовой или высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Иногда применяют  обратную методику — исследуют газохроматографические фракции  методом ТСХ. Для этого пластинку для ТСХ помещают на расстояние 1 мм от выходного отверстия газового хроматографа, к отверстию прикрепляют иглу шприца. Движение пластинки запрограммировано таким образом, чтобы индивидуальные пробы из газового хроматографа наносились на различные части пластинок. Нанесенные образцы хроматографируют обычным способом. Таким образом, разделенные вещества характеризуются по времени удерживания, а также по Rf и цветным реакциям на пластинке. Однако эффективность переноса вещества от газового хроматографа на пластинку для ТСХ обычно составляет 30—80% .

При использовании  инфракрасной спектроскопии зону вещества, подлежащую исследованию, соскабливают микрошпателем, помещают в канал иглы шприца над слоем порошка бромида калия и утрамбовывают. Бромид калия служит фильтром, задерживающим прохождение мелкого силикагеля через иглу. Стеклянный шприц вместимостью 1 мл заполняют ацетоном, соединяют с иглой и вещество элюируют по каплям на слой измельченного и высушенного порошка бромида калия массой 10 мг. Перед добавлением каждой капли растворителю дают полностью испариться. Для переведения адсорбированного вещества из силикагеля на бромид калия обычно достаточно 20 капель. Полученный порошок бромида калия с исследуемым веществом перемешивают микрошпателем и таблетируют (диаметр 1,5 мм).

Для получения  масс-спектра исследуемого вещества десорбированный раствор вводят шприцем через прокладку непосредственно в устройство для ввода образца в масс-спектрометр. Сочетание ТСХ и масс-спектрометрии использовано при определении полициклических ароматических углеводородов, так как определение их только хроматографическими методами малоэффективно из-за мешающего влияния сопутствующих примесей.

В настоящее время  ТСХ является одним из важных методов аналитической химии. Это непревзойденный метод анализа сложных смесей. Он прост по методике выполнения и аппаратуре, экспрессен, не требует для анализа больших количеств веществ.

4.Коэффициент  разделения компонентов и методы  его определения в тонкослойной хроматографии.

Метод тонкослойной хроматографии (ТХС), получивший в настоящее время  широкое распространение, был разработан Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер еще  в 1938 г.

В методе ТСХ неподвижная  твердая фаза тонким слоем наносится  на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. В 2—3 см от края пластинки на стартовую линию вносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. Диффузия в тонком слое происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс следует рассматривать как двумерный.