Ферменты

 

            3. Лабораторно-практические  работы.

       3.1.Выделить ферменты из биологического материала.

ПОЛУЧЕНИЕ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ  АМИЛАЗЫ.

2-3 ложечки  высушенной поджелудочной железы  растирают в ступке с добавлением  25 мл дистил. воды. Полученная масса  настаивается в течение 10-15 минут,  затем фильтруется. Фильтрат используется как ферментативный раствор. 

ПОЛУЧЕНИЕ САХАРАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ.

2-3 ложечки сухих  пекарских дрожжей растирают  в    течение 5-7 минут с  постепенным добавлением 25 мл дистил. воды. Полученная масса фильтруется. Фильтрат используется как ферментативный раствор. 

    3.2.Выяснить влияние рН среды  на активность фермента

МЕТОДИКА  ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВЛИЯНИЯ  РН СРЕДЫ

  НА АКТИВНОСТЬ  АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

    В три пронумерованные пробирки вносят по 2 мл фосфатного буфера с различным  значением рН (5,59; 6,81; 8,04). Приготовление буферного раствора: 

            pН                                   Na₂HPO₄                                           KH₂PO₄

     -----------------                     ---------------------                                ----------------

           5,59                                     0,5мл.                                                   9,5мл

           6,81                                     5,0мл.                                                   5,0мл.

           8,04                                     9,5мл.                                                   0,5мл. 

    Затем в пробирки добавляют по 1мл 1% р-ра крахмала и по 0,5 мл разбавленного (1:10) р-ра слюны и ставят их в водяную  баню при температуре 37^оС на 10 минут. Каждую минуту из 2-й пробирки берут каплю жидкости и смешивают с каплей р-ра йода на предметном стекле. Это повторяют до тех пор, пока проба из 2-й пробирки даст красно-бурое окрашивание. Через 1-2 минуты после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода.  

Практическое  занятие № 10.

Задание к занятию № 10.

  Тема: ферменты.

Учебные и воспитательные цели:

   - Общая цель занятия:  научить  использовать знания о строении  ферментов, регуляции их активности, изоферментах, иммобилизованных ферментах  в практической деятельности  врача.

   - Частные цели занятия: уметь определять активность амилазы слюны, влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов. 

1. Входной контроль  знаний

1.1. Тесты

1.2. Устный  опрос

2. Основные вопросы  темы.

2.1.Строение  простых и сложных ферментов  (на примере гидролаз, дегидрогеназ).

2.2.Понятие  о каталитическом (активном) и регуляторном (аллостерическом) центрах ферментов.

2.3.Активаторы  и ингибиторы ферментов, механизмы  их влияния и значение.

2.4.Аллостерическая  регуляция активности ферментов  (регуляция по типу обратной связи).

2.5. Изоферменты, иммобилизованные ферменты, значение в медицине.

               3. Лабораторно-практические работы.

3.1. Определить  активность амилазы слюны.

             3.2. Выяснить влияние активаторов  и ингибиторов на активность ферментов.

              4. Выходной контроль.

   4.1. Тесты

   4.2. Ситуационные задачи.

5. Литература.

           5.1. Материалы лекций.

           5.2. Николаев А.Я. Биологическая  химия. М.: «Высшая школа», 1989, с.61-70, 78-81, 84-92.

            5.3.Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая  химия. М.: «Медицина», 1990, с. 97-108, 115-124, 129-131.

           5.4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая  химия. М.: «Медицина», 2004, с. 120-129, 143-157, 163-165.

            5.5. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М.: Медицина, 1983, раб 28, 24 (п. 3).

              

    2. Основные вопросы  темы.

     2.1.Строение простых и сложных ферментов (на примере гидролаз, дегидрогеназ).

    По  составу ферменты делятся на простые и сложные.

    Простые ферменты состоят из аминокислот. К  ним относятся ферменты желудочно-кишечного  тракта – α-амилаза, пепсин, трипсин, липаза и др. Все эти ферменты относятся к 3 классу – гидролаз.

    Сложные ферменты состоят из белковой части – апофермента и небелковой – кофактора. Каталитически активный комплекс «фермент – кофактор» называется холоферментом. В качестве кофакторов могут выступать как ионы металлов, так и органические соединения, многие из которых являются производными витаминов.

    Например, оксидоредуктазы используют в качестве кофакторов Fe²+, Сu²+, Mn²+, киназы Mg²+; для глутатионпероксидазы – фермента, обезвреживающего перекись водорода, требуется селен.

    Коферменты  – это органические вещества, которые  непрочно связаны с белковой частью. Например, НАД-зависимые дегидрогеназы состоят из белка и коферментов НАД, НАДФ, производных витамина РР.

    Простетическая  группа – это коферменты, которые  прочно (часто ковалентно) связаны  с апоферментом. Например, флавиновые дегидрогеназы состоят из белка и простетических групп ФАД, ФМН, производных витамина В₂. Апофермент определяет направленность или специфичность действия фермента.  

2.2.Понятие  о каталитическом (активном) и регуляторном (аллостерическом)  центрах ферментов.

    Активный центр – это относительно небольшой участок, расположенный в узком гидрофобном углублении (щели) поверхности молекулы фермента, непосредственно участвующий в катализе. Активный центр – это точная пространственная организация больших ансамблей, построенных из аминокислотных остатков: серин – ОН группа; цистеин – SH группа; лизин – NH2 группа; гистидин – имидазольное кольцо; глутаминовая, аспарагиновая кислоты – СООН группа.

    По  первичной структуре эти аминокислотные остатки располагаются на различном  расстоянии друг от друга, при образовании вторичной, третичной структур аминокислотные остатки сближаются, формируя активный центр.

    Активный  центр включает субстратсвязывающий  участок, который отвечает за специфическое  комплементарное связывание субстрата, и каталитический участок непосредственного химического взаимодействия.

    В активный центр сложных ферментов  входит участок для связывания кофактора. Регуляторные (аллостерические) ферменты помимо активного центра имеют аллостерический  центр. К аллостерическому центру могут присоединяться гормоны или продукты реакции. Это приводит к изменению структуры активного центра. Эти вещества называются аллостерическими эффекторами (модификаторами). Эффекторы могут быть положительными (усиливают действие фермента) и отрицательными (блокируют действие фермента). 

2.3.Активаторы  и ингибиторы ферментов,  механизмы их влияния  и значение.

      На скорость химических реакций  оказывают влияние различные  вещества. По характеру влияния  вещества подразделяются на активаторы, увеличивающие активность ферментов, и ингибиторы (парализаторы), подавляющие активность ферментов.

    Активирование ферментов могут вызывать:

1. Присутствие кофакторов – ионы металлов  Fe²+, Mg²+, Mn²+, Cu²+, Zn²+, АТФ, липоевая кислота. 
2. Частичный их протеолиз.

    Ферменты  желудочно-кишечного тракта вырабатываются в виде неактивных форм – зимогенов. Под влиянием различных факторов происходит отщепление пептида с формированием активного центра и зимоген превращается в активную форму фермента. 

    Пепсиноген    НСl      пепсин + пептид

    

    Трипсиноген      энтерокиназа       трипсин + пептид

         

      Этот вид активирования предохраняет  клетки желудочно-кишечного тракта  от самопереваривания.

3. Фосфорилирование и дефосфорилирование. Например:

    неакт. липаза + АТФ → липаза-фосфат (акт. липаза);

    липаза-фосфат+Н3РО4 → липаза (неакт. липаза)

    Ингибиторы  по характеру своего действия подразделяются на обратимые и необратимые. В  основе такого деления лежит прочность  соединения ингибитора с ферментом.

    Обратимые ингибиторы – это соединения, которые  нековалентно взаимодействуют с ферментом и могут отщепляться от фермента.

    Необратимые ингибиторы – это соединения, которые  образуют ковалентные, прочные связи  с ферментом.

    Необратимое ингибирование может быть специфическим  и неспецифическим.

    При специфическом ингибировании ингибиторы тормозят действие определенных ферментов, связывая отдельные функциональные группы активного центра. Например, тиоловые яды ингибируют ферменты, в активный центр которых входят SН-группы; угарный газ (СО) ингибирует ферменты, имеющие в активном центре Fe²+.

    Неспецифические ингибиторы тормозят действие всех ферментов. К ним относятся все денатурирующие факторы (высокая температура, органические и минеральные кислоты, соли тяжелых  металлов и др.).

    Обратимое ингибирование может быть конкурентным. При этом ингибитор является структурным аналогом субстрата и конкурирует с ним за связывание в субстратсвязывающем участке активного центра.

    Отличительная особенность конкурентного ингибирования  состоит в том, что его можно  ослабить или полностью устранить, повысив концентрацию субстрата.

    Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) – фермент цитратного цикла, дегидрирует сукцинат, превращая  его в фумарат. Малонат, который  структурно похож на сукцинат, связывается  в активном центре СДГ, но не может  дегидрироваться. Поэтому малонат – конкурентный ингибитор СДГ.

    Многие  лекарственные препараты являются конкурентными ингибиторами ферментов. Например, сульфаниламидные препараты, являясь структурными аналогами  парааминобензойной кислоты (ПАБК) –  основного фактора роста болезнетворных микроорганизмов, конкурируют с ней за связывание в субстратсвязывающем участке активного центра фермента. На этом основано противомикробное действие сульфаниламидных препаратов. 

2.4.Аллостерическая  регуляция активности  ферментов (регуляция по типу обратной связи).

   Регуляция по типу обратной связи (аллостерическая  регуляция активсти ферментов).

    В некоторых многоступенчатых метаболических путях конечный продукт ингибирует регуляторный (аллостерический) фермент  процесса.

    При повышении концентрации продукта реакции „Z” он занимает аллостерический центр регуляторного фермента „Е₁”. Это приводит к изменению конформации активного центра „Е₁”, в результате чего фермент „Е₁” ингибируется и не может соединиться с субстратом „А”. Эта регуляция обеспечивает адаптацию организма к изменяющимся условиям. Например,