Азотфиксирующие микроорганизмы и их роль в природе и хозяйственной деятельности человека

  В результате активации и хемосорбции  азота нитрогеназой высвобождается энергия и происходит разрыв двух связей в молекуле азота. На это расходуется 7,8*105 дж/моль. Третья связь разрывается  при внедрении в молекулу активированного  азота: водорода, активированного, в  свою очередь, ферментами дегидрогеназной  и гидрогеназной систем. Получающийся аммиак или другие восстановленные  продукты азота реагируют с кетокислотами, образуя аминокислоты.

  В симбиотических азотфиксирующих системах фиксация азота осуществляется в  результате сложного взаимодействия микроорганизма и высшего растения. Несомненно, механизм процесса азотфиксации в клубеньках имеет своеобразные особенности, обусловленные  совместным функционированием двух совершенно различных по своим свойствам партнеров, присутствием леггемоглобина, принимающего участие в процессе фиксации, и наличием бактероидов.

 
Риунок 7 . Схема действия нитрогеназы.

  Процесс фиксации в симбиотической системе  иллюстрируется схемой (рисунок 8), где  видно, что растение и бактерии функционируют  в единстве и что электрон-транспортной цепью между ними является леггемоглобин.

  Высшее  растение по схеме является источником углеродсодержащих соединений. Их трансформация  обеспечивает получение энергетического  материала для процессов активации  и восстановления N2. Активированный азот — конечный акцептор электронов. Продукты неполного окисления углеродсодержащих  соединений служат акцепторами NHs и  в клубеньках образуют аминокислоты, которые становятся доступными высшему  растению. Растения выполняют роль накопителя углеродсодержащих соединений (продуктов фотосинтеза) и поставщика энергии. Клубеньковые бактерии в стадии бактероидов проявляют способность с помощью нитрогеназы переносить активированный водород к азоту. Путь от Na до NHs рассматривается как восстановительный процесс.

  В последнее время получены доказательства локализации процесса азотфиксации в бактероидах с помощью измерения  азотфиксирую-щей активности у фракции бактероидов, которую отделяли центрифугированием от других фракций клубенька. [4]

 
Рисунок 8. Схема симбиотической азотфиксации  

     Фиксация азота клубеньковыми бактериями 

     Наибольший  вклад в биологическую азотфиксацию вносят клубеньковыми бактериями (ризобии). Ризобии представляют собой грамотрицательные бактерии, образующие клубеньки с растениями семейства бобовых. Клубеньковые бактерии теперь делят на пять родов: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium (быстрорастущие) и Bradyrhizobium (медленнорастущие).

     В основе способности инфицировать корневую систему хозяина лежит сложнейший и не вполне ясный молекулярный механизм, имеющий решающее значение в симбиотической фиксации азота. На первом этапе происходит приближение микробной клетки к  растению за счет ее способности передвигаться  в ответ на узнавание химических продуктов, выделяемых из корней растения (хемотаксис). Происходит  контактное взаимодействие микроорганизма с растением. В этом процессе важное место отводится так называемому лектин-углеводному узнаванию растения микроорганизмом. Лектин корневых волосков растений (углеводузнающий белок) узнает углевод поверхности бактерий и прочно связывается с ним. Происходит взаимное узнавание партнеров и подготовка к формированию симбиотической системы. Растение в нано- или пикомолярных концентрациях начинает продуцировать специфичные флавиноиды, которые активируют гены вирулентности (Nod-гены) ризобий. Nod-гены кодируют синтез Nod-факторов (липоолигосахаридов), вызывающих у растения-хозяина скручивание корневых волосков и образование клубеньковой меристемы.  В месте резкого сгиба волоска пектолитические ферменты растения разрушают клеточную стенку, через которую бактерии и проникают внутрь. Вокруг этих бактерий образуется полость – инфекционная нить, стенки ее образованы растительными клетками, а внутреннее пространство заполнено полисахаридами растения и микросимбионта.

     Далее происходит эндоцитоз ризобий из инфекционной нити внутрь клеток растения-хозяина. В цитоплазме растительной клетки бактерии окружаются специальными перибактероидными  мембранами (ПБМ), синтезируемыми в основном растительной клеткой и частично ризобиями. Количество ризобиальных клеток внутри ПБМ зависит от вида растений и обычно составляет от 1 до 10 клеток. Бактериальные клетки, окруженные общей ПБМ, называются симбиосомой и являются основной структурно-функциональной единицей симбиоза.

     Вскоре  ризобии в ПБМ преобразуются  в особые симбиотические формы –  бактероиды, имеющие в три-пять раз большие размеры, чем свободноживущие бактерии. Все это способствует формированию на поверхности корней клубеньков. Азотфиксирующий клубенек состоит из следующих частей: а) инфицированная бактериями ткань, б) проводящая ткань, поставляющая углеводы и выносящая продукты азотфиксации, в) меристема, за счет которой идет рост клубенька. Морфология и число клубенька строго определяется растением-хозяином, что возможно связано с большой энергоемкостью их образования.

     Клубеньковые  бактерии более экономно используют энергию, необходимую для фиксации азота, затрагивая 3-4 г углеводов  на 1 г азота, в то время как  свободноживущие азотфиксирующие  бактерии затрачивают 50 - 100 и более  граммов на фиксацию 1 г азота. Это  связано с тем, что у  
свободноживущих азотфиксаторов фиксация азота происходит в процессе их роста, и потому большое количество энергии потребляется на этот рост. Кроме того, в целях создания благоприятных условий для активности нитрогеназы - фермента, участвующего в фиксации азота, для снижения парциального давления кислорода усиливается дыхание, что связано с затратой энергии. Эти расходы энергии отсутствуют у клубеньковых бактерий, поскольку фиксация азота происходит в бактероидах, клетках, прекративших рост, а внутри клубеньков создаются благоприятные условия  
для активности нитрогеназы, в том числе сниженное содержание кислорода. Очень существенно то, что фиксируемый клубеньковыми бактериями азот на  90 - 95% передается бобовым растениям. Бобовые, получая связанный азот от клубеньковых бактерий, не зависят или мало зависят от обеспечения минеральным азотом почвы и потому могут успешно произрастать совместно с другими растениями на почвах, бедных доступными формами азота. Количество азота, фиксируемого клубеньковыми бактериями бобовых, сильно варьирует от фитоценоза к фитоценозу, а в пределах конкретных фитоценозов может изменяться от года к году. Оно определяется участием  
бобовых в фитоценозах, условиями среды и эффективностью соответствующих рас бактерий. Для некоторых лугов в Новой Зеландии с травостоями, где преобладает клевер, отмечена фиксация азотом до 450 - 550 кг/га.

     Общий уровень азотфиксирующей активности свободно живущих организмов невысок. В зависимости от вида и условий  существования они накапливают  в год от 10 до 30 - 40 кг связанного азота  на гектар.[5] 

     Биохимия  азотфиксации 

     Микроорганизмы, усваивающие молекулярный азот, называются диазотрофами. Основным элементом симбиоза является нитрогеназа – многомерный фермент, состоящий из комплекса двух белков: MoFe-белка и Fe-белка. Нитрогеназы из разных азотфиксаторов несколько различаются своими молекулярными массами и содержанием металлов. Каждый из белков, в свою очередь, состоит из нескольких субъединиц. Молекулярная масса MoFe-белка различных нитрогеназ находится в пределах 200-250 кДа. Фермент содержит по два атома молибдена, 28-34 атома железа и 18-24 атома серы на одну молекулу. Молекулярная масса Fe-белка колеблется от 50 до 70 кДа и также содержит атомы железа и серы. Нитрогеназа синтезируется в бактероидах и является катализатором фиксации азота:

N2 + 6e- + 6H+ 2NH3

     Этот  процесс требует затраты энергии. По расчетам для клеток Rhizobium восстановление одной молекулы N2 требует затраты 25-35 молекул АТФ, то есть на каждый грамм  фиксированного азота расходуется  три-шесть грамм органического  углерода. Кроме АТР нужны также восстановленные пиридиннуклеотиды и ферредоксины в качестве восстановительной силы.

     Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью, т.е. обладает способностью восстанавливать широкий спектр соединений, например, превращать ацетилен в этилен. Данная реакция применяется для определения нитрогеназной активности ацетиленовым методом. Ацетилен восстанавливается только до этилена, который легко поддаётся количественному определению с помощью газовой хроматографии.

     Для активной работы нитрогеназы необходимы микроаэрофильные условия. Молекулярный кислород оказывает повреждающее действие на оба белка нитрогеназы, но более  чувствителен к O₂ Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к O₂ определяется прежде всего чувствительностью их металлоцентров, которые участвуют как в связывании субстрата, так и в переносе электронов. Поскольку при этом может происходить и ступенчатое восстановление O₂ по одноэлектронному механизму, в качестве продуктов такого восстановления возникают супероксидные ионы, перекись водорода и синглетный кислород, вносящие свой вклад в окислительное повреждение нитрогеназы. Нитрогеназные белки являются не единственным компонентом азотфиксирующей системы, чувствительным к O₂. Ферредоксины и флаводоксины, донирующие электроны на нитрогеназу, могут автоокисляться и подвергаться необратимым окислительным повреждениям.

     Микроаэрофильные  условия в клубеньке обеспечиваются диффузным барьером (слой плотно прилегающих друг к другу клеток во внутреннем кортексе) и синтезом леггемоглобина (гемоглобинподобный белок, синтезируемый растительными клетками). Леггемоглобин связывает O2, транспортирует его к симбиосомам, обеспечивая дыхательную активность клубеньков. Он составляет 30 % белка в клубеньках и придает им ярко-розовый цвет. Нитрогеназный комплекс, образующий аммиак из воздуха, действует по очень экономно. Если в среде обитания достаточно ионов аммония или нитратов, он прекращает работу.

     Потребление растениями аммиака, образовавшегося  при азотфиксации или восстановлении нитратов почвы, осуществляется ферментами, связанными с биосинтезом так называемых первичных аминокислот, прежде всего глутаминовой, аспарагиновой кислот и их амидов. Одним из активно изучаемых ферментов является, например, глютаминсинтетаза. Этот фермент катализирует реакцию

Глютаминовую кислота + NH3 + АТФ

     Этот  фермент встречается во всех организмах и принимает участие в присоединении  аммиака к глутаминовой кислоте  с образованием ее амида и последующим  использованием его в различных  реакциях синтеза азотсодержащих органических соединений. Близким по механизму  действия является и аспарагинсинтетаза:

Аспарагиновая кислота + NH3 +АТФ 

     Синтез  аминокислот и амидов происходит с участием и других ферментов: глутаматдегидрогеназы, аспартазы и т.д. В конечном итоге азот в виде аминогрупп вовлекается в серию биосинтетических реакций организма, поддерживая его жизненные функции.

Виды  азотфиксирующих  микроорганизмов

Свободноживущие азотфиксирующие микроорганизма.                   Азотобактер (AZOTOBACTER)

  В 1901 году Бейеринк выделил из почвы  аэробную неспорообразующую грамотрица-тельную  бактерию, фиксирующую молекулярный азот, и назвал ее Azotobacter chroococcum (в  родовом названии отражена способность  бактерии фиксировать азот, в видовом  — способность синтезировать  коричневый пигмент — chroo и образовывать кокковидные клетки -coccum). Азотобактер — типичный представитель свободноживущих микроорганизмов. Свободноживущие — это все те микроорганизмы, которые живут в почве независимо от того, развивается вблизи растение или нет.

 
Рисунок 1. Делящиеся клетки азотобактера, видны перитрихиальные жгутики, у A. macrocyto-genes видны полярные жгутики

  Культуры  азотобактера в лабораторных условиях отличаются полиморфизмом. Клетки разных видов азотобактера в молодом  возрасте показаны на рисунке 1. Молодые  клетки азотобактера подвижны; они  имеют многочисленные или единичные  жгутики (рисунок 1). У азотобактера обнаружены выросты, подобные фимбриям (рис.унок 2). В старых культурах клетки азотобактера покрываются плотной оболочкой, образуя цисты. Они могут прорастать, давая начало молодым клеткам (рисунок 3).

  Полиморфизм азотобактера зависит в значительной степени от состава среды, на которой  он выращивается. На среде с этиловым спиртом (в качестве единственного  источника углерода) азотобактер  длительное время сохраняет подвижность  и форму палочек. В то же время  на многих других средах полиморфизм  проявляется очень резко.

 
Рисунок 2-Фимбрпоподобные образования у клеток азотобактера.

  На  плотных питательных средах, не содержащих азота, азотобактер образует крупные  слизистые, иногда морщинистые колонии (рис. 176), окрашивающиеся при старении в желтовато-зеленоватый, розовый  или коричнево-черный цвет. Колониям разных видов азотобактера присуща  своя специфическая пигментация.

  К настоящему времени известен ряд  видов азотобактера: Azotobacter chroococcum, Az. beijerinckii, Az. vinelandii, Az. agilis, Az. nigricans, Az. galophilum.

 
Риунок 3- Цисты азотобактера. Зрелая циста, наполненная гранулами жира и окруженная толстой плотной оболочкой (справа), и прорастающая циста (растущая молодая клетка разрывает оболочку цисты — слева).

  Источником  азота для азотобактера могут  служить разнообразные минеральные (соли аммония, азотной и азотистой  кислот) и органические (мочевина, различные  аминокислоты) соединения. Однако если азотобактер развивается только за счет связанного в среде азота, он не выполняет своей основной функции  — фиксации молекулярного азота. Азотобактер обычно фиксирует до 10—15 мг молекулярного азота на 1 г использованного источника  углерода (например, глюкозы, сахарозы). Эта величина сильно колеблется в  зависимости от условий выращивания  культуры, состава питательной среды, ее кислотности, температуры, аэрации.

  По  отношению к источникам углерода В. Л. Омелянский (1923) назвал азотобактер  полифагом («всеядным»).

 
Рисунок 4- Развитие колоний A. chroococcum вокруг комочков почвы па безазотной среде.