Аналитические методы разделения

По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: одномерную, двумерную, круговую и электрофоретическую. Для одномерных хроматограмм используют бумажные полосы шириной 4,5-5 см и длиной 30-50 см.  Для получения двумерных хроматограмм хроматографирование производят дважды во взаимно противоположных направлениях: после обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет производить более тонкие разделения компонентов смеси.

Весьма эффективным оказалось  сочетание хроматографии и электрофореза, т. е. получение электрофоретических хроматограмм на бумаге. Воздействие электрического поля можно использовать или одновременно с хроматографированием, или последовательно, т. е. сначала провести электрофорез, а затем хроматографирование .

Качественный  состав пробы в методе бумажной распределительной хроматографии так же, как и в ТСХ, может быть установлен или по специфической окраске отдельных пятен на хроматограмме, или по числовому значению R_f каждого компонента.

Количественные определения  в распределительной, так же как  и в тонкослойной хроматографии, выполняются или по хроматографическим характеристикам (площади пятна  на хроматограмме и интенсивности  его окраски), или по методу вымывания. Нередко хроматограмму разрезают на отдельные части по числу пятен, каждое пятно обрабатывают соответствующим экс-рагентом и определяют количество экстрагированного вещества любым подходящим методом: фотометрическим, полярографическим и т. д.

Методики, основанные на использовании  хроматографических характеристик, довольно многообразны. Количество вещества можно определить методом шкалы, когда на одной и той же хроматограмме получают пятно раствора с неизвестной концентрацией и пятна нескольких стандартов. Концентрацию исследуемого раствора находят прямым сравнением площади пятна и интенсивности его окраски у исследуемого и у стандартного растворов.

Более точным является метод, основанный на применении градуировочного  графика S - lgc, где S — площадь пятна, с — концентрация. В указанных координатах график линеен. Используется также измерение интенсивности окраски пятна, которая пропорциональна концентрации. Методами распределительной жидкостной хроматографии успешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, смеси красителей и т. д.

2.3.1 Коэффициент  R_f

Нанесенные на бумагу хроматографируемые вещества переходят в подвижную  фазу и, перемещаясь с различными скоростями по капиллярам бумаги, разделяются, концентрируясь в различных участках бумажного листа. Однако в этом случае определить значение коэффициента распределения, как это было указано выше, не представляется возможным. Поэтому  для  количественной оценки способности разделения веществ на бумаге введен коэффициент R_f, представляющий отношение велечины смещения зоны вещества (x) к смещению фронта растворителя(x_f):

R_f = x/ x_f

 

Коэффициент R_f и коэффициент распределения K связаны следующим соотношением:

K =_{( - 1)}

 

где  A_подв и A_неподв – соответственно поперечные сечения бумаги, удерживающие подвижный и неподвижный растворители. 

Зная содержание воды в  бумаге, отношение  _{можно определить, исходя из массы абсолютно сухой бумаги и массы бумаги, пропитанной подвижным растворителем.}

На величину  R_f  влияют многие факторы: природа носителей, хроматографируемых веществ и растворителей, условия проведения эксперимента и др. однако для веществ, близких по свойствам, при постоянных условиях величина R_f является относительно постоянной и служит показателем, позволяющим определять вещества. Чем больше различие в величинах R_f разделяемых веществ, тем лучше разделение веществ.

 

2.4 Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Основное преимущество метода ТСХ перед бумажной хроматографией – более быстрое разделение веществ, устойчивость слоя сорбента-носителя по отношению к агрессивным проявителям и нагреванию, возможность изготовлять тонкослойные пластинки с любой толщиной слоя.

Метод ТСХ заключается в следующем: на стеклянную пластинку с нанесенным тонким слоем носителя (окись алюминия, кизельгур, силикагель т другие), так же как и на бумаге в бумажной хроматографии, на стартовую линию наносят микропипеткой анализируемые растворы. Пластинку погружают в элюент так, чтобы уровень элюента на 9-10 мм был ниже стартовой линии. По мере продвижения элюента по пластинке происходит разделение отдельных компонентов анализируемых веществ. Хроматографируют до тех пор, пока элюент поднимается на желательную высоту (обычно не выше 100 мм) от стартовой линии. Пластинку сушат и проявляют соответствующим реагентом, чтобы получить окрашенные пятна.

В идеальном случае в процессе разделения неизменное количество данного  вещества под действием потока элюента  движется независимо от сопутствующих  веществ вдоль неподвижной фазы. В процессе этого движения вещество непрерывно разделяется между двумя  фазами. Между попаданием молекулы в подвижную фазу и последующим  выходом из нее протекает некоторое  время. сумма этих интервалов времени  составляет определенную долю времени  хроматографического процесса, которую  можно обозначить как время пребывания молекулы в подвижной фазе. Время  пребывания различных молекул в  подвижной фазе определяется физическими  свойствами веществ и условиями  опыта. Различные скорости перемещения  веществ обусловлены разным временем пребывания в элюенте.

Молекулы веществ проходят в направлении потока элюента  различный путь. На хроматограмме  образуется зона с максимальной концентрацией  вещества в ее середине. Из-за поперечной диффузии зоны превращаются в пятна. Расширение пятен зависит от количества вещества и длительности хроматографического процесса. Положение пятен характеризуют величины R_f, так же, кА и в бумажной хроматографии. В зависимости от направления поступления элюента на пластинку различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии. Разделение веществ может осуществляться еще многократной двумерной, круговой или градиентной хроматографией. 

Разделение сложных смесей веществ методом ТСХ осуществляется в результате адсорбционных, распределительных или ионообменных процессов.

 

2.4.1 Основные характеристики

 

Схема ТСХ и экспериментально определяемые величины, которые характеризуют этот процесс, приведены на рис. 2.4

Сорбционные свойства системы в ТСХ характеризуются подвижностью R_f, которая рассчитывается из экспериментальных данных (рис. 2.4) по уравнению

 

R_f =  x₁ / x_f

где х₁ — расстояние от стартовой линии до центра зоны: x_f стояние, пройденное за это же время растворителем.

Строго говоря, при определении  подвижности вместо расстояний х_г и x_f следовало бы учитывать скорость движения соответствующих веществ в тонком слое, так как в теории ТСХ  принято считать, что скорость движения центра зоны хроматографируемого вещества составляет строго определенную долю скорости движения растворителя. Однако измерение этих величин затруднительно, а значения R_ft рассчитанные по соотношению , также характеризуют подвижность. По смысловому определению R_f как свойство, характерное для данной системы, не должно зависеть от концентрации и других факторов. Опыт показывает, однако, что воспроизводимость и постоянство значений R_f не всегда достаточны, особенно при анализе неорганических ионов. На R_f влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителя и другие факторы, не всегда поддающиеся   достаточному   контролю. На практике часто пользуются относительной величиной

R_f ._отн = R_{f, x} / R_{f CT}

где R_{f CT} также рассчитывается по уравнению.

 

Рисунок 2.4 ТСХ-схема:

a-a – стартовая линия;

b-b – граница фронта растворителя в конце опыта;

заштрихованные  пятна характеризуют положение  компонентов в тонком слое в конце  опыта.

Стандартное вещество (свидетель) в том же растворителе наносится на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях.

Число теоретических тарелок n в методе ХТС рассчитывается по соотношению

n  = 16(l н / l п)²

 

Значения 1_Н и 1_п определяются в соответствии с рис. 2.4                                           

 

Тогда высота Н, эквивалентная теоретической   тарелке, будет равна

 

 H = lн / n = lп² 16 lн

 

Коэффициент разделения в тонком слое K_f связан с числом теоретических тарелок и подвижностями R_f уравнением

где R     , R      — подвижности соседних компонентов смеси.

 

Теоретический анализ показывает, что при небольших значениях Rf и уменьшении длительности анализа размывание зоны вещества на сорбенте бывает максимальным, следовательно, концентрация вещества будет максимальна и чувствительность анализа увеличится. Уменьшение диаметра зерна в тонком слое приводит к увеличению продолжительности анализа и усиливает диффузное размывание.

Подложки для сорбента (пластинки) обычно изготовляют из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной  пленки. Одно из достоинств пленки состоит  в том, что она прозрачна примерно до 320 нм и это позволяет проводить  прямое фотометрирование многих веществ непосредственно в слое.

Сорбент может быть нанесен  на подложку в виде пасты (закрепленный слой), тонкого порошка (незакрепленный слой) или быть приготовленным при обжиге силикагеля на стеклянной пластине.

В качестве сорбента в ТСХ  применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал, целлюлозу и некоторые  другие вещества с высокой адсорбционной  способностью. Для характеристики сорбционной активности оксида алюминия часто используется шкала Брокмана, составленная по R_f стандартного набора красителей. Эффективно применяются в ТСХ в качестве сорбентов жидкие иониты и другие вещества, обладающие ионообменными свойствами и свойствами молекулярных сит (например, сефадексы).

Выбор растворителя зависит  от природы сорбента и свойств  анализируемых соединений. Часто  применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Например, при хроматографировании аминокислот используют смесь n-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов — водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

В восходящей хроматографии растворитель поднимается снизу вверх под действием капиллярных сил, в нисходящей — растворитель передвигается по слою вниз под действием и капиллярных, и гравитационных сил. Горизонтальная хроматография выполняется в виде круговой и со свободным испарением растворителя. В круговой хроматографии в центр горизонтально установленной пластинки вносят каплю анализируемой смеси и непрерывно подают растворитель, который под действием капиллярных сил движется в радиальном направлении от центра. Компоненты смеси располагаются в слое в виде концентрических

колец.

По окончании хроматографирования  зоны на хроматограмме проявляют  химическим или физическим способом. При химическом способе пластинку опрыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентом смеси. При обработке, например, парами иода четко проявляются непредельные соединения. В физических способах проявления используется способность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения, часто при добавлении флуоресцирующего индикатора, взаимодействующего с компонентами смеси. Вещества, обладающие радиоактивным излучением, обнаруживаются методом радиоавтографии с помощью различных фотоматериалов (бумаги или пленки). После проявления хроматограммы приступают к идентификации веществ и дальнейшему анализу.

 

2.4.2. Качественный  анализ

Проще всего идентификация  вещества может быть сделана, если пятно  определяемого вещества имеет характерную  окраску или определяемое вещество образует на хроматограмме окрашенное пятно под действием специального реактива. Однако число таких веществ, особенно органических, невелико, поэтому метод имеет ограниченное применение.

Наиболее общий подход к качественному анализу основан  на значениях R_f. Хроматографическая подвижность является чувствительной характеристикой вещества, однако она существенно зависит от условий определения. Эта трудность преодолевается путем проведения опыта в строго фиксированных стандартных условиях, которые регламентируют размер пластин, толщину слоя сорбента, объем пробы, длину пути фронта растворителя и другие факторы. При соблюдении стандартных условий получаются воспроизводимые значения R_f, которые можно использо вать в аналитических целях при сравнении с табличными, если они получены в тех же условиях опыта.

Самым надежным является метод  свидетелей, когда на стартовую линию рядом с пробой наносятся индивидуальные вещества, соответствующие предполагаемым компонентам смеси. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым, поэтому совпадение R_f компонента пробы и одного из свидетелей дает основания для отождествления веществ с учетом возможных наложений. Несовпадение R_f интерпретируется более однозначно: оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего компонента.

Интересные результаты получаются при сочетании ТСХ с другими  методами. При сочетании ТСХ с  газовой хроматографией пластинка становится своеобразным детектором. Выходящий из колонки газ направляется на стартовую линию пластинки и затем хроматографируется по методике ТСХ выбранным растворителем. Анализ тонкослойных хроматограмм позволяет независимым методом идентифицировать компоненты смеси, что увеличивает надежность анализа. Хроматографирование вещества методом ТСХ после прохождения газовой колонки может дать дополнительную информацию о составе смеси, в частности о компонентах, разделение которых методом газовой хроматографии было неполным. Сочетание ТСХ и газовой хроматографии позволяет также установить, все ли компоненты смеси вымываются из колонки, происходят ли химические изменения при хроматографировании, и решить некоторые другие вопросы.