Генотерапия применима
не только к наследственным
заболеваниям. Предстоит решить
проблему лечения генами "чумы
XX века" — синдрома приобретенного
иммунодефицита (СПИД), возникающего при
заражении вирусом иммунодефицита человека
(ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус,
поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь
удалось бы победить, если бы были найдены
новые гены, введение которых в зараженные
ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее
размножение вируса. Предложено множество
хитроумных способов борьбы со СПИДом
с помощью привнесенных генов. Все они
основаны на новейших данных о строении
и функционировании генома ретровируса.
Например, вводя прямо в мышцы больного
ретровирусные векторы, несущие отдельные
гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что
гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом
хозяина смогут дать информацию для синтеза
вирусных белков и произойдет "противоСПИДная"
иммунизация больного этими белками. Однако
еще не получено ощутимых результатов,
которые сулили бы успех в борьбе с вирусом
дикого типа, коварство которого заключается
в его изменчивости.
Огромные перспективы
открывает использование генотерапии
для лечения онкологических заболеваний.
Многолетние усилия ученых привели
к пониманию того, что рак —
это генетическое заболевание
и его развитие происходит
многостадийно, в результате серии
генетических нарушений, накапливающихся
в клетке. Следовательно, каждый
из таких отдельных генетических
эффектов может стать точкой
приложения генотерапевтического
подхода.
2.7 Получение трансгенных
животных
Если вводить ДНК
в клетки многоклеточного организма,
то результатом трансформации
будет изменение свойств лишь
небольшого числа клеток, которые
приобрели новый ген или гены.
Следовательно, для изменения
свойств всего организма следует
изменять геном половых клеток,
которые перенесут новые свойства потомкам.
У растений и животных целесообразно изменять
такие свойства, как скорость роста, устойчивость
к заболеваниям, способность адаптироваться
к новым внешним условиям. В качестве маркеров
в этом случае можно использовать полиморфизм
длины рестрикционных фрагментов (AFLP),
анализ мини-сателлитов, анализ микросателлитной
ДНК (SSR), гибридизацию и т.д.
Разработаны способы
введения генов в эмбриональные
клетки млекопитающих, мух и
некоторых растений. От работы
с довольно крупными яйцами
амфибий перешли к изучению
яйцеклеток и эмбрионов мыши,
которая представляет наиболее
изученное в генетическом отношении
млекопитающее.
Микроинъекцию клонированных
генов производят в один или
оба пронуклеуса только что
оплодотворенной яйцеклетки мыши.
Чаще выбирают мужской пронуклеус,
привнесенный сперматозоидом, так
как его размеры больше. После
инъекции яйцеклетку немедленно
имплантируют в яйцевод приемной
матери, или дают возможность
развиваться в культуре до
стадии бластоцисты, после чего
имплантируют в матку.
Можно вводить ген
в сперматозоиды и затем проводить ими
оплодотворение. Таким образом были инъецированы
гены интерферона и инсулина человека,
ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы
вируса простого герпеса и кДНК вируса
лейкемии мышей. Число молекул, вводимое
за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300
000, а их размер - от 5 до 50 кб. Выживает обычно
10 - 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся
из трансформированных яйцеклеток варьирует
от нескольких до 40%. Таким образом, реальная
эффективность составляет около 10%.
Интеграция чужеродных
генов неспецифична по отношению
к хромосомам, а число копий
чужеродного гена может различаться
от нескольких штук до 100 и более.
Эти гены образуют группу тандемных
повторов, объединенных по типу "голова
к хвосту". Чужеродная ДНК после
инъекции была обнаружена как
в соматических, так и в половых
клетках. Это означает, что интеграция
проходит на самых ранних стадиях
развития зиготы.
В нескольких случаях
гетерологичная ДНК наследовалась
в трех поколениях мышей, что
свидетельствует о стабильной
интеграции. Интегрировавшая в половые
клетки ДНК передается как
менделевский ген. Установлено,
что уровень экспрессии чужеродного
гена зависит от места интеграции
ДНК с хромосомами и от степени
ее метилирования, а также от
дифференцировки тканей. В некоторых
случаях удалось получить тканеспецифическую
экспрессию. Важно отметить что
специфические чужеродные гены
можно встраивать в геном клетки
таким образом, что они подчиняются
нормальным регуляторным сигналам.
В 1981 году Константини
и Лэси (Оксфорд) провели инъекцию
в яйцеклетки мыши фрагменты
хромосомной ДНК кролика длиной
19 килобаз. Эти фрагменты содержали
ген β-глобина кролика. Яйцеклетки культивировали
до стадии бластоцисты и имплантировали
в матку. У 24 мышей, родившихся в результате
развития имплантированных яйцеклеток,
проведены частичная гепатоэктомия. Анализ
ДНК из клеток печени показал, что у 9 мышей
встречается от 1 до 20 копий на клетку гена
β-глобина. После спаривания 4 трансформированных
самцов с нормальными самками получили
потомство из 18 животных. 6 из них также
имели ген β-глобина. Установлено, что
интеграция гена в клетки млекопитающих
происходит случайным образом и не связана
с конкретными областями хромосомы. Ген
нестабилен, может быть утрачен или стать
неактивным. Вместе с геном необходимо
вводить регуляторные последовательности.
Метод введения генов
в эмбриональные клетки имеет
ограничения. Не всегда удается
встроить чужеродную ДНК в
заданный участок хромосомы. Разработанные
методические примы пока не
позволяют заменить имеющийся
в геноме ген, вытесняя его,
не всегда удается подчинить
новый ген системе регуляции
организма.
При трансгенозе могут
возникать неожиданные проблемы.
Например, одни из первых работ
по генетической транформации
животных проводились путем встраивания
генов гормона роста. Перенос
гена гормона роста крысы мышам
увеличивал рост мышей в 2 раза.
Эксперименты по трансгенозу
генов гормона роста быка кроликам
также увенчались успехом. А
вот аналогичные эксперименты
по модификации крупного рогатого
скота привели к увеличению
прироста всего на 10-20%. Очевидно,
это связанно с тем, что у
мышей сохраняется широкая норма
реакции, и встраивание генов,
увеличивающих количество гормона,
заставляет генотип реализоваться
максимально полно. У домашнего
скота в результате направленной
селекции организмы работают
на верхнем пределе нормы реакции,
отсюда ожидаемый эффект не
проявился.
В нашей стране получены
свиньи, несущие ген соматотропина.
Они не отличались по темпам
роста от нормальных животных,
но изменение обмена веществ
сказалось на содержании жира.
У таких животных ингибировались
процессы липогенеза и активировался
синтез белка. К изменению обмена
веществ приводило и встраивание
генов инсулиноподобного фактора.
Такие трансгенные свиньи были
созданы для изучения цепочки
биохимических превращений гормона,
а побочным эффектом явилось
укрепление иммунной системы.
Самая мощная белоксинтезирующая
система находится в клетках
молочной железы. Если поставить
гены чужих белков под контроль
казеинового промотора, то экспрессия
этих генов будет мощной и
стабильной, а белок будет накапливаться
в молоке (животное-ферментер). Уже
получены трансгенные коровы, в
молоке которых содержится человеческий
белок лактоферрин. Этот белок
планируют применять для профилактики
гастроэнтерологических заболеваний
у людей с низкой иммунорезистентностью.
Это больные СПИДом, недоношенные
младенцы, больные раком, прошедшие
радиотерапию. Ведутся клинические
испытания такого молока. Уже
сейчас корпорация Genzyme Transgenics планирует
исследования с целью создания трансгенного
крупного рогатого скота, содержащего
в молоке человеческий альбумин. Был куплен
патент на получение эмбрионов, содержащих
геном клеток соединительной ткани (фибробластов),
включающий ген, ответственный за синтез
человеческого белка. Подобная технология
позволяет увеличить эффективность создания
трансгенных молочных животных, так как
при обычном впрыскивании генов в оплодотворенную
яйцеклетку рождается от только 5 - 10% трансформированных
животных, из них - несколько самцов, не
дающих молока.
Использование новой
технологии клонирования позволяет
получать животных только женского
пола, дающих трансгенный протеин.
Альбумин используется в терапии
для поддержания осмотического
давления в крови. Ежегодно
в мире требуется около 440 тысяч
литров плазмы крови для выделения
этого белка (стоимость около
1,5 млрд. $). Каждая молочная корова
может произвести 80 кг рекомбинантного
человеческого альбумина ежегодно.
Genzyme Transgenics занимается разработкой аналогичных
методов получения человеческого гормона
роста и β-интерферона.
В Англии созданы
трансгенные овцы, молоко которых
содержит фактор свертывания
крови.
В нашей стране были
попытки создать овец, продуцирующих
химозин (фермент для сыроварения).
Было получено 2 овцы, у одной –
ген не экспрессировался, у второй
содержание химозина достигало
300 мг/л. Однако потомство этой
овцы давало низкие удои –
порядка 50 кг за период лактации.
Причина заключалась в том,
что химозин вырабатывается в
виде предшественника – прохимозина,
который превращается в активный
фермент при рН=5. Было запланировано
получать именно прохимозин, но
в каких-то участках вымени
происходило снижение рН, что
приводило к активации химозина
непосредственно в организме.
Активный химозин свертывал молоко,
а оно закупоривало протоки
вымени. Сейчас пытаются решить
эту проблему.
В Подмосковье получены
кролики, выделяющие γ-интерферон,
эритропоэтин, но кролики не являются
традиционными продуцентами молока. Эксперименты
же по трансформации сельскохозяйственных
животных очень дорогостоящи – одно трансгенное
животное стоит десятки и сотни тысяч
долларов.
Трансгенных животных
получают и для целей ксенотрансплантации.
Одним из излюбленных доноров
органов являются свиньи, так
как имеется анатомическое сходство
органов и сходство иммунологических
свойств. Реакции отторжения при
трансплантации имеют сложный
механизм. Одним из сигналов для
атаки организма на чужой орган
являются белки, локализованные
на внешней поверхности мембраны.
У трансгенных свиней эти белки
заменены на человеческие.
Еще одно направление
трансгеноза – получение устойчивых
к болезням животных. Животноводство
держится на вакцинах, так как
селекция ведется преимущественно
на хозяйственно ценные признаки
– шерстистость, молочность и
т. д. Повышение устойчивости
– дело генных инженеров. К
защитным белкам относятся интерфероны,
поэтому ген интерферона встраивали
различным животным. Трансгенные
мыши получили устойчивость, они
не болели или болели мало,
а вот у свиней такого эффекта
не обнаружено.
Другое направление
– введение генов, кодирующих
антисмысловую РНК. Для животноводства
острой проблемой являются лейкозы,
вызываемые РНК-вирусами. Трансгенные
кролики, несущие гены, отвечающие
за присутствие в клетке антисмысловой
РНК, были устойчивы к лейкозам.
Трансгенных животных
можно использовать для изучения
наследственных заболеваний мозга
и нервной системы. Гены болезни
Альцгеймера (отложение белка
β-амилоида приводит к образованию характерных
бляшек) и гены, отвечающие за развитие
эпилепсии, болезней мозга вводятся в
геном нормальных животных; при этом получают
трансгенных животных-моделей, на которых
можно испытывать различные терапевтические
приемы.
Трансгенных животных
стали использовать для исследования
воспалительных и иммунологических
заболеваний человека, например, ревматоидного
артрита. Моделируются болезни,
связанные с липидным обменом.
Заключение
Хотя генетика и
генная инженерия уже играют
огромную роль в медицине и
сельском хозяйстве, основные
результаты ещё впереди. Нам
ещё очень многое предстоит
узнать о том, как работает
сложная генетическая система
в нашем организме и у других
видов живых существ.
Необходимо определить
функции и назначение каждого
гена, определить, каковы условия
его активации, в какие периоды
жизни, в каких частях тела
и при каких обстоятельствах
он включается и приводит к
синтезу соответствующего белка.
Далее, необходимо понять, какую
роль играет в организме этот
белок, выходит ли он за пределы
клетки, какие сообщения несёт,
какие реакции катализирует, как
влияет на запуск биологических
процессов в других частях
организма, какие гены активирует.
Отдельной сложной задачей является
решение проблемы сворачивания
белков - как, зная последовательность
аминокислот, составляющих белок,
определить его пространственную
структуру и функции. Эта проблема
требует новых теоретических
знаний и более мощных суперкомпьютеров.
Но учёные не пасуют
перед масштабом этой задачи.
Расшифровка генома человека
потребовала более десяти лет,
решение проблемы сворачивания
белков может занять чуть дольше,
но когда она будет решена,
человек сможет полностью контролировать
жизненные процессы в любых
организмах на всех уровнях.
Список литературы
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис
Дж. и др. Молекулярная биология
клетки. Т. 1 - 3. М.: Мир, 1994.