РДНК-биотехнология. Способы биотрансформации клеток

 

 Для обработки клеток-рецепиентов  используются грубо очищенные  препараты хромосом, так как хромосомы  при этом разрушаются меньше  всего. Количество хромосом для  обработки 1 клетки ограничено. Лучше  использовать не более 20 хромосом  на 1 клетку-рецепиент, так как  при высоких концентрациях хромосом  в суспензии они агглютинируют.  Рецепиентная клетка содержит  фрагменты донорных хромосом, которые  могут встраиваться в геном,  могут реплицироваться самостоятельно. Во введенных фрагментах часто  наблюдаются делеции.

 

 Не все клетки способны  к трансформации геномной ДНК  с высокой частотой. Человеческие  фибробласты эффективно включают  плазмидную ДНК и почти не  включают геномную.

 

 Микроинъекция ДНК  в клетки млекопитающих стала  возможной с появлением прибора  для изготовления микропипеток  диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора  (рис. 45). Так, плазмиды, содержащие  фрагмент вируса герпеса с  геном тимидинкиназы (ТК) и плазмиду  рВR322, были инъецированы в ТК--клетки и было показано, что ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с помощью микроинъекций был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом. В принципе, при наличии хорошего оборудования можно за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

 

 

 

 

Рис. 4. Введение ДНК путем  микроинъекции

 

 

 Электропорация основана  на том, что импульсы высокого  напряжения обратимо увеличивают  проницаемость биомембран. В среду  для электропорации добавляют  клетки и фрагменты ДНК, которые  необходимо ввести в клетки (рис. 46). Через среду пропускают высоковольтные  импульсы (напряжение 200 - 350 В, длительность  импульса 54 мс), приводящие к образованию  пор (электропробой) в цитоплазматической  мембране, время существования и  размер которых достаточны, чтобы  такие макромолекулы, как ДНК,  могли из внешней среды войти  в клетку в результате действия  осмотических сил. При этом  объем клетки увеличивается.

 

 Напряженность электрического  поля и продолжительность его  действия, концентрации трансформирующей  ДНК и реципиентных клеток  для каждой системы клеток  подбирают экспериментально, с тем  чтобы достичь высокого процента  поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях  электропорации количество трансформантов  может достигать 80% выживших клеток.

 

 Электропорация — физический, а не биохимический метод, и  это, по-видимому, обусловливает  его широкое применение. Многочисленные  исследования продемонстрировали, что электропорация может успешно  использоваться для введения  молекул ДНК в разные типы  клеток, такие как культивируемые  клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и протопласты растений. Электропорирующий эффект высоковольтного  разряда на бислойную липидную  мембрану, по-видимому, зависит от  радиуса ее кривизны. Поэтому  мелкие бактериальные клетки  эффективно поглощают ДНК при  значительно большей напряженности  (10 кВ/см и более), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1—2 кВ/см.

 

 Электропорация — наиболее  простой, эффективный и воспроизводимый  метод введения молекул ДНК  в клетки. Однако до недавнего  времени этот метод использовался  в ограниченном числе лабораторий  в связи с отсутствием серийных  приборов — электропораторов. Появление  и совершенствование таких приборов  в ближайшие годы приведет  к широкому применению данного  подхода в генетической инженерии  самых разных типов клеток.

 

 

 

Рис. 5. Метод электропорации

 

 

 «Мини-клетки» получают  путем блокирования донорных  клеток митозе колцемидом. При  продолжительной обработке клеток  колцемидом в них вокруг каждой  хромосомы формируется новая  ядерная мембрана. Обработка цитохалазином  В и центрифугирование приводит  к образованию мини-клеток, представляющих  микроядра, инкапсулированные в  цитоплазматическую мембрану.

 

 Полученные мини-клетки  очень чувствительны к разного  рода воздействиям, поэтому для  слияния подбирают специальные  мягкие условия. Метод трудный,  капризный, эффективность низкая  – 10-6 – 10-7.

 

 Упаковка в липосомы  используется для защиты экзогенного  генетического материала от разрушающего  действия рестриктаз.

 

 Липосомы - сферические  оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого  встряхивания смеси водного раствора  и липидов, либо обрабатывая  ультразвуком водные эмульсии  фосфолипидов. Липосомы, состоящие  из фосфатидилсерина и холестерина  наиболее пригодны для введения  ДНК в клетки животных и  растений. Системы переноса с  помощью липосом низкотоксичны  по отношению к клеткам.

 

 Метод биологической  баллистики (биолистики) является одним  из самых эффективных на сегодняшний  день методов трансформации растений, особенно однодольных.

 

 Суть метода заключается  в том, что на мельчайшие  частички вольфрама, диаметром  0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора,  содержащего необходимую для  трансформирования генную конструкцию.  Вольфрамовые частички, несущие  ДНК, наносятся на целлофановую  подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

 

 Обычно клетки, располагающиеся  непосредственно по центру, погибают  из-за огромного количества и  давления вольфрамовых частиц, в  то время как в зоне 0,6—1  см от центра находятся наиболее  удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят  на среду для дальнейшего культивирования  и регенерации.

 

 С помощью биолистической  пушки были протрансформированы  однодольные растения, такие, как  кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При  этом были получены стабильные  растения-трансформанты. Кроме успехов  в получении трансгенных однодольных,  биолистическая трансформация применяется  для прямого переноса ДНК в  эмбриогенную пыльцу и дальнейшего  быстрого получения трансгенных  дигаплоидных растений, которые  являются важным этапом в селекционной  работе. В настоящее время этим  методом была проведена трансформация  растений табака и после регенерации  гаплоидных растений получены  стабильные трансформанты.

 

 

2.3 Способы прямого введения  гена в клетку

 

 

 В настоящее время  бактерия E. coli является самой изученной клеткой из всех существующих. У большинства наиболее полно изученных фагов клеткой - хозяином является также E. coli.

 

 Протопласт E. coli одет в муреиновый мешок, прилегающий к внешней мембране. E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим физиологической компетентностью к поглощению экзогенной ДНК. Поэтому необходимо создать условия, позволяющие преодолеть барьер клеточной стенки. Сначала получают сферопласты путем обработки клеток лизоцимом в изотоническом растворе.

 

 Липополисахаридный слой  внешней мембраны грамотрицательной  бактерии стабилизирован двухвалентными  катионами, поэтому для разрыхления  внешней мембраны E. coli используется комплексообразователь этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), которая связывает двухвалентные катионы. При обработке EDTA часть липополисахаридов высвобождается из внешней мембраны клетки, и лизоцим может достигнуть муреинового мешка и гидролизовать его. Это ведет к повышению проницаемости клеточной оболочки. Усовершенствование методов получения сферопластов E. coli и их трансфекции позволили достичь достаточно высокой эффективности трансформации молекулами ДНК различных фагов.

 

 Обнаружено, что на  инфекционность существенное влияние  оказывает форма молекул фаговых  ДНК, которую они принимают  in vivo. Фаги с кольцевой или линейной, но быстро замыкающейся ДНК (лямбоидные фаги) характеризуются наибольшей эффективностью трансфекции.

 

 Успешное проведение  экспериментов на кишечной палочке  стало стимулом для проведения  аналогичных исследований с другими  прокариотическими организмами.  Наибольших успехов удалось достичь  с клетками Bacillus subtilis. B. subtilis - непатогенный почвенным микроорганизм, растущий в строго аэробных условиях. Бациллы не образуют токсинов и непатогенны ни для животных, ни для человека, тогда как клеточная стенка E. coli содержит эндотоксин, который довольно трудно отделить от продуктов генной инженерии. Кроме того, клеточная стенка бацилл имеет простую структуру и бактерии могут секретировать многие белки в культуральную жидкость. 20 различных видов бацил секретируют в культуральную жидкость более 40 ферментов с внеклеточной локализацией. E. coli секретирует в среду относительно мало белков, а выделение и очистка их затруднены. В бациллах также обнаружены плазмиды и фаги, которые к настоящему моменту уже хорошо изучены.

 

 Чужеродные гены клонируют  в так называемых челночных  векторах. Эти вектора с одинаковым  успехом реплицируются в клетках  нескольких хозяев, в данном случае, в клетках E. coli и B.subtilis. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов этих плазмид.

 

 Гены E. coli со своими регуляторными районами не функционируют в B.subtilis, поэтому были использованы собственные гомологичные районы B.subtilis.

 

 Для конструирования  рекомбинантной ДНК, содержащей  в своем составе ген, который  должен экспрессироваться, придерживаются  следующей стратегии. Синтезируют  кДНК или из клонотеки выделяют  клетки, несущие фрагмент генома  с нужным геном, и клонируют  их в соответствующем векторе.  Фрагменты геномной ДНК подвергают  модификации - удаляют из них  некодирующие области и участки  соседних генов. Часто для проведения  этой операции необходимо секвенирование  данного фрагмента ДНК. Затем  конструируются промежуточные рекомбинантные  ДНК, в которых ген помещается  под контроль бактериальных регуляторных  элементов (промотор, оператор, точка  связывания с рибосомами). Эти  регуляторные элементы выделяют  из гибридных плазмид, сконструированных  специально как источники регуляторных  элементов. Полученная конструкция  встраивается в подходящий вектор, например, pBR 322, и ген экспрессируется в бактериальной клетке.

 

 Однако удобнее встраивать  ген в специальный вектор для  экспрессии, который уже содержит  регуляторные элементы, обеспечивающие  активную экспрессию после введения  рекомбинантной плазмиды в бактериальную  клетку. К таким эффективным регуляторным  участкам относится, например, сильный  промотор гена бэта-лактамазы  (ген устойчивости к пенициллину,  входящий в состав плазмиды  pBR 322). Ряд генов, в том числе и ген инсулина, встраивали в сайт рестрикции Pst I, который расположен в структурной части гена. Промотор этого гена обеспечивает эффективную транскрипцию, которая продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не дойдет до сигнала терминации встроенного гена.

 

 В качестве примера  маркирования вектора могут служит  первые эксперименты с E. coli, а точнее с одной из ее плазмид рBR322, проведенные Гилбертом для получения инсулина. Плазмида pBR322 содержит 2 гена, которые определяют устойчивость к ампициллину и тетрациклину. Рестриктаза PstI расщепляет плазмиду в средней части гена, кодирующего фермент устойчивости к апициллину. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферазы надстраивали последовательность из четырех нуклеотидов с остатками гуанина. Затем, как обычно, с помощью лигаз "вшивали" ген проинсулина, получая рекомбинантную ДНК. Встроенный в плазмиду фрагмент ДНК нарушал синтез фермента, разрушающего ампициллин, но ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, оставался активным. Трансформированные таким образом клетки E. coli синтезировали гибридный белок, содержащий последовательности пенициллазы и проинсулина, поэтому биологически активный инсулин получали путем отщепления пенициллазы и средний сегмент проинсулина.

 

 С другой стороны,  если фрагмент чужеродной ДНК  встраивается в один из генов  устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание  фрагмента чужеродной ДНК в  один из этих генов легко  детектировать по исчезновению  у бактерий устойчивости к  данному антибиотику.

 

 

2.4 Введение генов в  клетки млекопитающих

 

 

 Манипуляции с клетками  млекопитающих можно разделить  на 2 большие группы: эксперименты  с соматическим клетками и  эксперименты по трансформации  половых клеток. В последнем случае  конечный результат – получение  трансгенных организмов.

 

 Характеристика векторов  для переноса генов в животные  клетки

 

 Одними из лучших  носителей для введения чужеродной  информации в животную клетку  являются вектора на основе  ретровирусов, например, на основе  вируса лейкоза мышей. Они обеспечивают  высокоэффективный перенос генов  и их стабильное встраивание  в хромосому клеток-мишеней. В  основном трансформации животных  клеток осуществляют либо с  помощью ретровирусов (около 40% от  всех трансформаций), либо путем  упаковки ДНК в липосомы (25%), реже  используют аденовирусы, так как  они могут вызывать сильный  иммунный ответ, кроме того, невозможно  их повторное введение.