Полимеразная цепная реакция. Перспективы применения в лабораторной диагностике туберкулёза

       Следует  также сказать, что РНК-содержащие вирусы, например, HVC, также доступны для анализа методом ПЦР. Для этого перед основной стадией амплификации проводят реакцию обратной транскрипции с использованием фермента обратной транскриптазы, в результате чего из РНК синтезируются молекулы ДНК. Разрабатываются новые подходы к регистрации продуктов реакции. Использование генных зондов заменяет необходимость применения электрофореза.

Применение  ПЦР для детекции микобактерий туберкулезного комплекса. 

     Классическими методами выявления M.tuberculosis из патологического материала остаются бактериоскопия, культуральный метод с использованием различных по составу питательных сред и биологический метод.

       В последние годы для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний  используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который обладает высокой чувствительностью, специфичностью и быстротой получения результатов. Для ускоренной лабораторной диагностики туберкулёза метод ПЦР находит всё более широкое применение. 

       Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации выбранных специфических участков генома бактерий рода Mycobacterium (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti), их дальнейшей детекции и идентификации. Аналитическая чувствительность метода, определяемая при последовательных разведениях суспензии бактериальных клеток, очень высока и составляет от 1 пг до 5 фг микобактериальной ДНК, что эквивалентно выявлению 1-10 бактериальных клеток.

       В таблице 1 приведена сравнительная  характеристика по чувствительности и  продолжительности исполнения микробиологических методов и ПЦР.  

Таблица 1.

Сравнительная чувствительность и продолжительность  исполнения различных лабораторных методов выявления микобактерий туберкулезного комплекса

       В настоящее время существует ряд разработок по использованию ПЦР в диагностике туберкулеза, и на рынке диагностических средств предлагается широкий спектр коммерческих наборов для детекции M.tuberculosis методом ПЦР – реакции.  

       Для инициирования ПЦР при определении  микобактерий туберкулеза в клинических образцах используются различные праймеры. Одни направлены на амплификацию фрагментов ДНК генов, кодирующих микобактериальные антигены, такие как белок теплового шока (белок 65 kD ), антиген b (38 kD) , МРВ 64; другие - на амплификацию повторяемых последовательностей в хромосоме микобактерий туберкулезного комплекса; третьи - на амплификацию рибосомальной РНК. 
             Целью нашего исследования было проведение сравнительного анализа чувствительности и специфичности двух коммерческих наборов для выявления M.tuberculosis («МТБ-КОМ» ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ и «Политуб» НП фирмы «Литех», НИИ физико-химической медицины) и оценки перспективности их использования в ранней диагностике туберкулёза.

       Работа  проводилась на базе лаборатории микробиологии Уральского НИИ фтизиопульмонологии и лаборатории молекулярной генетики Уральского госуниверситета.

       В процессе работы исследовались образцы  патологического материала от 40 больных с диагнозом туберкулёз лёгких (диаграмма 1).

       ДНК микобактерий выявляли из мокроты, промывных  вод бронхов и плеврального содержимого (диаграмма 2).

       Результаты, полученные в ходе исследования, представлены в таблице 2. 

       Таблица 2.

       Выявление генетического материала с использованием различных коммерческих наборов.

       Из  представленных данных  таблицы 2 видно, что выявление генетического  материала M.tuberculosis из мокроты, промывных вод бронхов и плеврального содержимого выше при использовании тест-системы «МТБ-КОМ». По нашим данным набор «МТБ-КОМ» также обладает рядом преимуществ по сравнению с тест-системой «Политуб»:

       1)более  высокая чувствительность набора;

       2)система  интерпретации результатов, предложенная  в наборе «МТБ-КОМ» позволяет  исключить ложно-негативные результаты;

       3)в  наборе «МТБ-КОМ» мишенью для  праймеров выбраны участки IS6110 – элементов, которые представлены несколькими копиями на бактериальную хромосому (1-25), тогда как в наборе «Политуб» мишенью является участок гена МРВ 64, представленный лишь одной копией на бактериальный геном;

       4)Важным  преимуществом  набора «МТБ-КОМ  является то, что в его состав  входит стандартный реагент для  пробоподготовки образца к этапу выделения ДНК.

       Таким образом, проведённые исследования позволяют сделать вывод - для  укоренной лабораторной диагностики  туберкулёза следует использовать тест-систему «МТБ-КОМ».  
 
 

Литература. 

    1. Альварес  Фигероа М.В., Лепеха Л.Н., Никоненко Б.В., Шипулина О.Ю., Шипулин Г.А. Выявление М. tuberculosis в крови методом ПЦР (экспериментальная модель). / В сб.: Генодиагностика в современной медицине. Материалы 3-ей Всероссийской конференции. М., 2000.-с.277-279.

    2. Альтшулер М.Л., Генерозов Э.В., Денисова Т.С., Владимирский М.А., Андросова М.Н., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Адамович Н.В., Говорун В.М. Выявление мутаций в гене rpoВ, обуславливающих резистентность М. tuberculosis к рифампицину. / В сб.: Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Материалы II Всероссийской конференции. М., 1998.-с.94-95.

    3. Бонецкий А.А., Тухватшин Р.Р., Филипченко А.И., Митина А.М. /Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - новое слово в диагностике инфекционных заболеваний / Здравоохранение Кыргызстана.- 1999, №1.- С.42-45.

    4. Вишневский Б.И., Мирлина Е.Д. ПЦР-диагностика  микобактерий туберкулеза методом  полимеразной цепной реакции  при туберкулезе различных локализаций. // В сб.: Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза. Материалы научно-практической конференции. Обнинск, 1996.-c. 14.

    5. Голышевская В.И., Черноусова Л.Н., Шашкина Е.Ф., Ларионова Е.Е., Коваленко  О.О., Денисова Т.С., Говорун В.М., Бочкарев Е.Г. Применение ПЦР для диагностики туберкулеза легких. / В сб.: Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. Материалы II Всероссийской конференции. М., 1998.-с.93.

    5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Москва. - НПФ “Литех”.- 1998.- 16 с.

    6. Федоров Н.А., Суханов Ю.С., Асади-Мобархан А.Х., Артемьев М.И. Полимеразная цепная реакция. Методическое пособие для начинающих. Принципы и практические рекомендации для ее постановки с целью детекции микроорганизмов. Москва.- 1996.- 34 с.