Реферат: 

Полимеразная  цепная реакция.

Перспективы применения в    лабораторной диагностике  туберкулёза. 
 
 
 

       Исполнитель: Камаев Е.Ю. 
 
 
 
 
 
 
 
 

Екатеринбург

2002 
 
 

Введение. 
 

       В 1983 г. произошло событие, которое  произвело революционный переворот  в методологии микробиологической диагностики. Американский ученый Кэри Мюллис изобрел метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий клонировать в условиях in vitro любой участок ДНК любого организма. Человеку удалось раскрыть и поставить себе на службу одно из самых великих таинств живой природы - способность биологической субстанции к воспроизведению. В 1983 г. американский журнал “Science” назвал это открытие самым выдающимся открытием последних лет. Научное сообщество по достоинству оценило разработку Кэри Мюллиса, присудив ему за изобретение ПЦР-анализа Нобелевскую премию.

       С  быстротой молнии метод распространился  по всему миру, быстро выйдя  из лабораторий научных институтов  в сферу практического клинического  использования. Диагностика инфекционных заболеваний, в том числе вызванных агентами, трудно поддающимися культивированию, генотипирование микроорганизмов, оценка их вирулентности, определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам, генодиагностика и генетическая дактилоскопия, пренатальная диагностика - вот далеко не полный перечень направлений медицины, где с успехом применяется ПЦР.

Принцип  ПЦР

 

       ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) является  универсальным носителем генетической  информации у всех живых существ  на Земле (исключение - РНК-содержание микроорганизмы).

         ДНК представляет собой двойную  нить, скрученную в спираль. Каждая  нить состоит из соединенных  последовательно нуклеотидов. В  состав ДНК входят нуклеотиды  четырех типов (аденин - А, гуанин - Г, тимин - Т, цитозин - Ц). Последовательность из трех нуклеотидов кодирует одну аминокислоту. Чередование нуклеотидов в ДНК обеспечивает кодировку всех молекул белка, образующихся в данном организме. Нуклеотиды попарно комплементарны, это означает, что нуклеотиду А одной нити ДНК соответствует нуклеотид Т другой нити, а нуклеотиду Г одной нити соответствует нуклеотид Ц второй нити. Взаимодействие между парными нуклеотидами обеспечивают водородные связи. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5’-концу одной нити соответствует 3’-конец второй нити. Построение нити ДНК идет от 5’-конца к 3’-концу. 

       

       Рисунок 1. Строение нуклеотидов. 

       С  помощью специальных ферментов  происходит расплетение спирали  в том ее участке, где должна  происходить репликация. Другие  ферменты обеспечивают разрыв  водородных связей и расхождение нитей. Одна из цепей (+) используется в качестве основной матрицы. У ее 5’-конца фиксируется фермент ДНК-полимераза, который обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплементарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, так как расплетение молекулы ДНК идет в обратном направлении, то новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются.

       Для  того чтобы фермент ДНК-полимераза  начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера - небольшого одноцепочечного фрагмента ДНК, который, соединяясь с комплементарным участком одной из цепей родительской ДНК, образует стартовый блок для наращивания дочерней нити. Таким образом, репликация ДНК включает в себя три основные стадии: 

  1) расплетение спирали ДНК и  расхождение нитей (денатурация);

  2) присоединение праймера;

  3) достраивание цепи дочерней нити. 

       Как  же эти процессы можно реализовать  в пробирке? Осуществить денатурацию  ДНК in vitro довольно легко. Дело в том, что водородные связи, за счет которых нити ДНК удерживаются в спаренном виде, не очень прочны и обычное нагревание раствора, содержащего молекулы ДНК до 93-95^оС приводит к расхождению нитей. Однако здесь встает другая проблема. Если в реакционную смесь поместить фермент ДНК-полимеразу, то нагревание раствора свыше 90 ^оС приведет к необратимой денатурации фермента с потерей его активности. Решить проблему помогло открытие термостабильной ДНК-полимеразы, получившей название taq-полимеразы, которая была обнаружена у термофильных бактерий Thermis aquaticus, обитающих в термальных источниках. Оптимум работы taq-полимеразы находится в диапазоне 70-72 ^оС и она благополучно переносит нагревание до 95^оС.

         Обязательным компонентом, необходимым для работы ДНК-полимеразы, является праймер. Геном каждого организма содержит уникальные последовательности нуклеотидов, не повторяющиеся больше ни у каких других видов организмов. Сейчас во всем мире идет активная работа по расшифровке нуклеотидных последовательностей геномов различных микро- и макро-организмов, в том числе и человека. Ожидается, что к 2003 году геном человека будет полностью расшифрован. В настоящее время уже расшифрованы нуклеотидные последовательности многих вирусов и бактерий. Существуют компьютерные банки данных, где можно получить информацию о нуклеотидной последовательности практически всех известных возбудителей инфекционных заболеваний.

       При  разработке праймера требуется  найти фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической  консервативностью и присутствовал бы только у интересующего нас вида микроорганизмов, при этом длина фрагмента должна составлять примерно 20 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы. В соответствии с найденной последовательностью нуклеотидов и синтезируется праймер. Поскольку наращивание дочерних нитей ДНК может идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, то для работы ДНК-полимеразы на второй цепи тоже требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера. Фактически, праймеры, присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Такие фрагменты ДНК называются ампликонами. Длина ампликона может составлять несколько сот нуклеотидов. Меняя пару праймеров, мы можем переходить от анализа одного возбудителя к анализу другого.

       Итак, поместив в пробирку материал, содержащий интересующую нас  ДНК-матрицу, смесь четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, служащих кирпичиками, из которых будет строиться дочерняя нить ДНК, обеспечив подходящие условия рН, а также присутствие необходимых ионов (Mg⁺⁺), добавив пару праймеров и термостабильную taq-полимеразу, мы можем осуществить реакцию амплификации in vitro (рис.2). 

         

         Для этого требуется задать  соответствующий температурный  режим:

 1) нагреваем реакционную смесь  до 93^оС – происходит расхождение нитей ДНК;

 2) снижаем температуру до 60 ^оС – происходит присоединение праймеров к соответствующим участкам цепей ДНК;

3)  повышаем температуру до 72 ^оС – начинает работать taq-полимераза – происходит достраивание фрагмента цепи ДНК (рис.3):  

     

    Рисунок 3. Первый цикл амплификации.  

Время  протекания синтеза 20-40 секунд, а  время, необходимое на проведение  всего цикла, - примерно 3 минуты. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК – ампликона (рис. 4)

 

 Рисунок 4. Второй цикл амплификации. 

       В  последующих циклах ампликоны  служат матрицей для синтеза  новых цепей. Таким образом, происходит  накопление ампликонов в растворе  по формуле 2ⁿ, где n - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула искомой ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 10⁸ молекул ампликона. Такого количества ДНК достаточно для ее регистрации методом электрофореза. Если в растворе не окажется ни одной молекулы ДНК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул ДНК, реакция ПЦР не пройдет.

       Для  проведения амплификации используются  специальные аппараты – амплификаторы, представляющие собой термостат  для пробирок с регулируемой по заданной

программе  температурой (рис. 5)

       

.

       Рисунок 5. Амплификатор. 

       Полученные  продукты ПЦР анализируются с  помощью электрофореза в агарозном  геле. Длина пробега ДНК в агарозе  зависит от размера молекулы  ДНК, а поскольку размер образующихся в результате ПЦР ампликонов известен, метод электрофореза позволяет точно их идентифицировать. Окрасив фореограмму бромистым этидием и поместив гель в лучи ультрафиолета, мы увидим наличие розовой полосы в той пробе, где присутствует исследуемая ДНК и отсутствие полосы в пробе, не содержащей искомой ДНК.

Преимущества  метода ПЦР

•  Прямое определение  наличия возбудителей

Многие  традиционные методы диагностики, например иммуно-ферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся  продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

•  Высокая специфичность

Высокая  специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

•  Высокая чувствительность

Метод  ПЦР позволяет выявлять даже  единичные клетки бактерий или  вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает  наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 10³-10⁵ клеток).

•  Универсальность  процедуры выявления  различных возбудителей 

Материалом  для исследования методом ПЦР  служит ДНК возбудителя. Благодаря  сходству химического состава  нуклеиновых кислот всех организмов  ПЦР анализ может быть с успехом применен для выявления практически всех возбудителей инфекций. При этом в одной биопробе можно диагностировать сразу несколько инфекционных агентов. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота, сперма, слезная жидкость), соскобы эпителиальных клеток, биоптаты, клетки крови, сыворотка.

•  Высокая скорость  получения результата  анализа

Для  проведения ПЦР-анализа не требуется  выделение и выращивание культуры  возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов.

•  Возможность диагностики  хронических и  латентных инфекций

Особенно  эффективен метод ПЦР для диагностики  трудно культивируемых, некультивируемых  и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится  сталкиваться при латентных и  хронических инфекциях, поскольку  этот метод позволяет избежать  сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

       Метод  ПЦР постоянно развивается и  совершенствуется. Одним из направлений развития является повышение точности анализа. С этой целью в реакционную смесь вносятся компоненты для второй ПЦР, продукты которой служат внутренним контролем для основной реакции. Развивается количественная ПЦР, позволяющая оценить степень бактеремии или вирусемии, что важно при мониторинге некоторых заболеваний. Для повышения чувствительности и специфичности используется двухстадийная ПЦР, когда ставится две амплификации с применением внешних и внутренних праймеров. С помощью подбора праймеров на генетически изменчивых участках ДНК микроорганизмов, разрабатываются системы, позволяющие проводить генотипирование микроорганизмов и выявлять формы, обладающие большей вирулентностью или устойчивостью к антибиотикам.