Невидимый орган-микрофлора человека

    Подходящий  для решения такой задачи метод  появился в России в начале 90-х  прошлого уже века. Он был разработан на базе исследований НИИ биологического приборостроения при поддержке  академика РАН Г.А.Заварзина и  гранта Министерства экологии и охраны недр РФ «Экологическая безопасность России».  Метод основан на выявлении присутствия микроорганизмов в объектах окружающей среды (воде, почве, стоках и т.п.) по специфическим для них химическим веществам – маркерам из числа жирных кислот, альдегидов и стеринов, входящих в состав их клеточной стенки. Специфичность означает, что подобные вещества содержатся только в липидах микроорганизмов и не содержатся в среде их обитания. Поэтому, имея достаточно чувствительный метод анализа их можно обнаружить и измерить количественно непосредственно в среде обитания, избежав необходимости предварительно культивировать их на искусственных средах. Это оказалось возможным сделать с помощью метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (сокращенно – ГХ-МС). Существо анализа состоит в прямом извлечении с помощью химической процедуры высших жирных кислот из образца, подлежащего исследованию (почвы, ила, клинического материала), их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализа состава в динамическом режиме на масс-спектрометре. Поскольку хроматограф соединен в едином приборе с масс-спектрометром и снабжен компьютером с соответствующими программами автоматического анализа и обработки данных, сам процесс анализа занимает 40 мин. Его результатом является определение состава микробных маркеров с точностью 2% относительных. Вместе с пробоподготовкой и расчетом состава микробного сообщества по отдельной программе стандартная процедура контроля 170 микроорганизмов в пробе занимает около 5 часов.  

    Метод детектирования микроорганизмов по ЖК-маркерам сродни генетическому (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 16sРНК и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего  синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Поэтому профиль ЖК бактерий является их визитной карточкой или фингерпринтом как отпечатки пальцев людей (Митрука, 1978). Он так же консервативен, как строение ДНК, но и так же подвержен мутациям под действием факторов окружающей среды. Стабильность набора жирных кислот, составляющих клетки микробов, подтверждается исследованиями в области бактериальной палеонтологии, которые показывают, что до глубины времен в 2,5 млрд лет состав ЖК отдельных  микробов и пула их жирных кислот в целом остается постоянным (Шеховцова, 2002). Бактерии, законсервированные в донных отложениях древних озер Антарктиды (возраст 1,5 миллиона лет), удается оживить в лабораторных исследованиях и показать их идентичность современным видам по молекулярным признакам – составу жирных кислот клеточных стенок (Воробьева, 2002).

    По  этому принципу построена хемодифференциация микроорганизмов, которая широко используется как метод их идентификации и  подтверждения таксономического положения (Minnikin, 1985). Он применяется для работы с монокультурами микроорганизмов и основан на использовании очень больших баз данных, содержащих сведения о составе жирных кислот нескольких тысяч штаммов бактерий и микроскопических грибов. Примером такой системы является специализированный хроматограф Microbial Identification System, выпускаемый фирмой MIDI Inc., Делавер, США [Stead, 1992]. Особенности состава жирных кислот теперь используют наряду с другими параметрами в бактериальной таксономии и клинической бактериальной диагностике [Вейант, 1999 ].

    Методология анализа микробных сообществ  методом ГХ-МС была опубликована как  в отчете по теме гранта Минэклогии РФ «Экологическая безопасность России», так и в последовавшем описании патента на способ анализа. Она распространена при поддержке академиков РАМН Ю.Ф. Исакова и А.А.Ворбьева и проф. Н.В.Белобородовой на диагностику  воспалительных процессов и дисбиозов  в клинической практике. Суммарно метод в приложении к экологическим, биотехнологическим и клиническим  проблемам изложен в докторской диссертации Г.А. Осипова (1996),  пяти кандидатских диссертациях, статьях в отечественной и зарубежной периодике, пособиях для врачей. Часть материала представлена в Интернет на сайте Русского медицинского сервера www.rusmedserv.com/microbdiag на русском и www.rusmedserv.com/microbdiag/eng на английском языках. 

Основы  метода анализа микробных  сообществ с использованием масс-спектрометрии

    В основе метода микробной диагностики  лежат многочисленные исследования последних двадцати лет отечественных  и зарубежных ученых в области  жирнокислотного состава микробной  клетки и хемодифференциации микроорганизмов. Это труды C.W. Moss, E.Jantzen, D.B. Drucker, C.Asselineau, M.Goodfellow, D.E.Minnikin за рубежом З.П.Васюренко, Л.В.Андреева, В.И.Седова, С.Г.Батракова, Б.В.Розынова, Е.А.Киприановой и других в России и бывшем СССР. 

    Он  развивался параллельно с исследованием  экологических микробных сообществ  по принципу  специфики PLFA – фосфолипидных жирных кислот, корифеем в области которого является американский ученый из Университета штата Теннеси (Ноксвилл) D.C.White (milipids@aol.com) и его последователи D.Ringelberg, P.D.Nichols. Однако в отличие от российских им не удалось разработать методику масштабного количественного видового анализа микробных сообществ в экологии и медицине по микробным маркерам и суммарным профилям жирных кислот. 

    Наболее близко к диагностике инфекционных заболеваний по маркерам подошел  шведский ученый Lennart Larsson из Унивеситета  Лунда (lennart.larsson@mmb.lu.se), с которым мы в настоящее время сотрудничаем. 

    Итак, вернемся к кишечнику, то есть к населяющим его микроорганизмам. По современным  представлениям они являются основными  переработчиками потребляемой человеком  пищи в молекулярную форму. Только в  таком виде она может быть доставлена посредством всасывания на кишечной стенке в кровь и далее в  клетки тела. Кроме того, микробы  синтезируют в своих клетках  множество необходимых человеку веществ – витаминов, ферментов, незаменимых аминокислот и других. От стабильности этого процесса и  зависит здоровье, следовательно - тонус  и качество жизни человека. Как  отмечалось, для  контроля и управления микробиотой кишечника необходим количественный метод анализа ее состава, и он получен в виде опосредованного определения ее состава по данным масс-спектрометрии жирных кислот. При использовании этого метода накоплена информация по пристеночной микрофлоре тощей, подвздошной и ободочной кишок путем ГХ-МС анализа микробных маркеров в биоптатах, получаемых в отделениии патологии тонкого кишечника ЦНИИГ, возглавляемом профессором Пафеновым А.И., при исследованиях здоровых добровольцев и больных с синдромом раздраженного кишечника и антибиотико-ассоциированной диареей. Эти исследования впервые позволили установить характер распределения микроорганизмов по отделам кишечника. Их сопоставление с анализом фекалий у тех же пациентов показали, что адекватно динамике заболевания и лечения пробиотиками меняется только пристеночная микробиота. Микрофлора фекалий каких-либо корреляций с процессом не обнаруживает.

    Нам удалось измерить концентрацию микробных  компонентов непосредственно в  месте обитания, где присутствуют сами клетки микробов кишечной стенки. Поэтому мы вправе делать прямые доступные  нам сопоставления между концентрацией  маркеров и числом микробных клеток в условиях отсутствия пищевой липидной компоненты, поскольку биоптаты получали натощак. Такая логика убеждает нас  в том, что мы измерили ведущую  микрофлору кишечной стенки. Ведущую  в количественном отношении, так  как оказалось, что при наличии  биоптата весом 4мг мы можем детектировать  микроорганизмы начиная с концентрации 10⁴ - 10⁵ кл/г, поэтому, значительная часть микрофлоры осталась вне поля наших возможностей. Как оказалось, общая численность микроорганизмов кишечной стенки в норме имеет величину в пределах (0,5-1,3)х10¹¹ кл/г в зависимости от отдела кишечника.

    Плотность заселения стенки кишечника в  дистальном направлении  меняется мало: в подвздошной кишке она в два раза меньше, а в толстой в полтора раза больше, чем в тощей. Измеренная нами пристеночная микрофлора оказалась существенно более концентрированной, чем просветная (по литературным данным [Schaechter, 1993]), которая в тонкой кишке на шесть а в подвздошной кишке на пять порядков ниже по численности (до 10⁵ – 10⁶ кл/мл соответственно), и только в ободочной кишке соответствует таковой в ее содержимом. Видовой состав  микроорганизмов соответствует известным представлениям о компонентах кишечной микрофлоры, в особенности – микроорганизмов фекалий [24]. Однако сходство ограничивается категориями общего характера: качественного состава и приоритетного (рангового) содержания основных элементов кишечного микробиоценоза. Действительно, в толстом кишечнике и фекалиях существенно больше анаэробов.

    Полученная  нами общая численность микроорганизмов  для фекалий находится в пределах интервала значений 0,6-5´ 10¹¹ кл/г, что согласуется с известными литературными данными измерений генетическим и культурально-биохимическим методами. Совпадает с известными оценками и относительное количество анаэробов в них, которое по нашим данным составляет 88%. Родовое распределение трудно сравнивать с литературными данными, так как в них приводится очень широкий диапазон значений, - в пределах 3-6 порядков. Тем не менее, совпадает наша оценка о приоритете рода Eubacterium, численность которых имеет порядок  10¹¹ кл/г (10⁹ – 10¹² по литературным данным), о количестве бактероидов 10¹⁰ кл/г (10¹⁰ - 10¹² по известным данным), клостридий - 6 х 10¹⁰ кл/г (10⁵ - 10¹¹ соответственно), бифидобактерий 10¹⁰ кл/г (10¹⁰ - 10¹²), а также по энтерококкам, энтеробактериям, лактобациллам  и стафилококкам. Этот результат позволяет утверждать что анализ микробиоты фекалий методом ГХ-МС по жирным кислотам клеточной стенки микрорганизмов дает достоверные данные об их численности. Следовательно, можно считать так же достоверными приводимые здесь сведения о составе микроорганизмов в биоптатах кишечной стенки.

    Результаты  разных исследований микробиоты фекалий  отводят бифидобактериям в их составе почти от 100% до 0,1% (табл. 1). Диапазон в три порядка вряд ли вызван тем, что люди разные, - в каждом исследовании приводится серьезная  статистика и добросовестная аналитическая  процедура. Разницу следует, скорее, отнести к особенностям сопоставляемых методов количественных измерений. Не вдаваясь в детали, можно заключить, что эффект доминирования бифидобактерий создает рутинная практика анализа  только бифидобактерий и условно-патогенной микрофлоры при исследованиях дисбактериозов. Как видно из поля зрения микробиолога при этом выпадают эубактерии, бактероиды и клостридии, которых в фекалиях по современным оценкам по крайней мере в несколько раз больше, чем бифидобактерий. Это заблуждение выглядит естественным, если вспомнить, что в рамках общей микробиологии принято считать, что в микробном сообществе в среднем культивируемыми являются не более 20% микроорганизмов любого местообитания. Что касается фекалий, то по оценкам молекулярно-генетическими методами так же оказывается, что определение 60-80% их микробиоценоза не доступно для культуральных методов. Данные масс-спектрометрии коррелируют с генетическими  (в рамках сопоставимости микробиологических количественных измерений) и одинаково показывают, что эубактерий, бактероидов и клостридий вместе и по отдельности на порядок больше, чем бифидобактерий.

    Применение  масс-спектрометрического метода дало возможность измерить численность  более 50 таксонов микроорганизмов кишечника  не только в фекалиях, но и в отделах  самого кишечника, путем анализа  их маркеров (жирных кислот) непосредственно  в биоптатах, полученных при интестиноскопии и колоноскопии с ретроградной илеоскопией. Эти данные показывают, что там также доминируют эубактерии, а их видовой состав существенно меняется по длине кишечника. Следует отметить филогенетическое родство эубактерий и клостридий. В определителе Берджи 9-го издания прямо сказано, что род Eubacterium создан для удобства, чтобы поместить в него  слабо спорообразующие клостридии.

    Таким образом, кишечная микробиота представляет собой доминирующий континуум штаммов и видов родов Clostridium и Eubacterium при равновеликом суммарном количестве бактероидов, бифидобактерий и лактобацилл. 

    Приведенные данные свидетельствуют о важности рода Eubacterium в формировании и функционировании кишечной микробиоты. Теперь уже трудно, после проведенного анализа филогенетических связей, оторвать его от рода Clostridium (по крайней мере группы C.coccoides) и рассматривать их как пищеварительно важную группу пептолитических и целлюлолитических организмов. Следует отметить принципиально важную особенность  представителей рода Eubacterium, заключающуюся в способности образовывать водород. Это ключевое свойство консорциумов микроорганизмов, осуществляющих дайджест органического субстрата при анаэробных процессах в природе (болота), в рубце жвачных и в биотехнологии при анаэробном сбраживании разного рода отходов и получении биогаза. Мукозный слой кишечника человека по существу является аналогичным биореактором. Там идет образование метана, следовательно, работают архебактерии-метаногены, эффективность которых строго зависима от концентрации водорода в системе. В метаногенном сообществе водородные бактерии играют ключевую регуляторную роль еще и благодаря обратной связи процесса продукции и потребления водорода на первичный процесс расщепления углеводов с образованием ацетата. При СРК, как следует из наших измерений, наибольшие изменения претерпевает численность эубактерий, что должно приводить к увеличению концентрации водорода в системе. Действительно, ранее экспериментально показано четырехкратное увеличение концентрации водорода в выдыхаемом воздухе у больных с СРК (King, 1998) и его возвращение в норму при снятии симптомов  в результате ограничительной диеты.

    Основную  долю (от 70% в тощей кишке до 90 в  фекалиях) микроорганизмов во всех отделах кишечника  составляют анаэробы. Второе место  по численности в тощей кишке занимают аэробные актиномицеты – 17% (в фекалиях их всего 0,7 %). Аэробные кокки (стафилококки, стрептококки, энтерококки) и коринеформные бактерии) – составляют 5% колонизации тонкого кишечника по сравнению с 0,7 % в фекалиях. Доля энтеробактерий и энтерококков по отделам кишечника и в фекалиях близка к 2%.