Молочнокислое брожение и семейство Lactobacillaceae

Молочнокислое брожение и семейство Lactobacillaceae   

Молочнокислые бактерии объединяют в сем. Lactobacillaceae. Хотя эта группа морфологически гетерогенна (включает длинные и короткие палочки, а также кокки), в физиологическом  отношении ее можно охарактеризовать достаточно хорошо. Все относящиеся к ней бактерии грам-положительны, не образуют спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus) и в подавляющем большинстве неподвижны. Все они используют в качестве источника энергии углеводы и выделяют молочную кислоту. В отличие от Enterobacteriaceae, тоже образующих лактат, молочнокислые бактерии способны только к брожению; они не содержат гемопротеинов (таких, как цитохромы и каталаза). Несмотря на это, Lactobacteriaceae могут расти в присутствии кислорода воздуха; будучи анаэробами, они все же аэротолерантны. Если какая-нибудь бактерия растет в аэробных условиях, но не образует каталазу, ее с большой ве­роятностью можно отнести к молочнокислым бактериям. 

Потребность в  факторах роста. Еще один отличительный признак молочнокислых бактерий-это их потребность в ростовых веществах. Ни один представитель этой группы не может расти на среде с глюкозой и солями аммония. Большинство нуждается в ряде витаминов (лак­тофлавине, тиамине, пантотеновой, никотиновой и фолиевой кислотах, биотине) и аминокислот, а также в пуринах и пиримидинах. Культивируют эти бактерии преимущественно на сложных средах, содержащих относительно большие количества дрожжевого экстракта, томатного сока, молочной сыворотки и даже крови. Неожиданным оказалось то, что некоторые молочнокислые бактерии (и другие организмы, осуществляющие брожение) при росте на средах, содержащих кровь, образуют цитохромы и даже, возможно, способны осуществлять фосфорилирова-ние в дыхательной цепи. Молочнокислые бактерии не могут, следовательно, синтезировать порфирины; если же порфирины добавлены в питательную среду, то некоторые из этих бактерий способны образовать соответствующие геминовые пигменты. 

Таким образом, молочнокислые бактерии-это своего рода «метаболические инвалиды», которые, вероятно в результате своей специализации (рост в молоке и других средах, богатых питательными и ростовыми веществами), утратили способность к синтезу многих метаболитов. С другой стороны, многие из них обладают способностью, которой нет у большинства других микроорганизмов; они могут использовать молочный сахар (лактозу). В этом они сходны с многими кишечными бактериями (например, Escherichia coli). Лактоза в растительном царстве, по-видимому, не встречается; она образуется у млекопитающих, выделяется с молоком и соответственно с ним же поглощается. Таким образом, способность использовать лактозу можно считать приспособлением к среде, характерной для кишечника млекопитающих. Лактоза-дисахарид, который, прежде чем вступить на путь катаболизма гексоз, должен быть расщеплен: 

Лактоза + Н20       ^Галактозидаза ^   0-Глюкоза + D-Галактоза 

Галактоза после  фосфорилирования  превращается  в  глюкозофосфат. 

В связи с  образованием больших количеств  молочной кислоты питательная среда  для молочнокислых бактерий должна быть хорошо забу-ферена. Чаще всего с этой целью добавляют карбонат кальция. На ага-ризованной среде со взвесью СаСОэ («меловом агаре») образование кислоты   обнаруживается   по   прозрачным   ореолам   вокруг   колоний. 

Распространение и места обитания. Распространение молочнокислых бактерий в природе определяется их сложными потребностями в питательных веществах и способом получения энергии (только брожение). Эти бактерии почти никогда не обнаруживаются в почве или водоемах. В естественных условиях они встречаются: 

а)  в молоке, местах его переработки и молочных продуктах

(Lactobacillus lactis, L. bulgaricus, L. helveticus, L. casei, L. fermentum, L

brevis; Streptococcus lactis, S. diacetilactis); 

б) на растениях  и на разлагающихся растительных остатках

(Lactobacillus plantarum, L. delbriickii, L. fermentum, L. brevis; Streptococcus

lactis; Leuconostoc mesenteroides); 

в) в кишечнике  и на слизистых оболочках человека и животных

(Lactobacillus acidophilus; Bifidobacterium; Streptococcus faecalis, S.

salivarius, S. bovis, S. pyogenes, S. pneumoniae). 

Streptococcus faecalis -обычный  обитатель кишечника человека; S. bovis распространен в пищеварительном  тракте жвачных. Многие стрептококки  являются безобидными обитателями  слизистых рта, дыхательных и мочевых путей, половых органов; однако среди стрептококков есть и паразиты крови-весьма вирулентные возбудители болезней. 

Благодаря образованию  больших количеств молочной кислоты, к которой сами они в значительной степени толерантны, молочнокислые бактерии при подходящих условиях могут довольно быстро размножаться, вытесняя другие микроорганизмы. По этой причине их легко культивировать на элективных средах и легко выделять. «Естественные накопительные культуры» этих бактерий содержатся в кислом молоке и молочных продуктах, кислом тесте, кислой капусте, силосе и т.п. 

Катаболизм углеводов  и продукты брожения. В зависимости  от того, какие продукты образуются при сбраживании глюкозы-только молочная кислота или также другие органические продукты и С02,-молочнокислые бактерии принято подразделять на гомофермен-тативные и гетероферментативные (табл. 8.2). Это старое деление отражает коренные различия в путях катаболизма Сахаров. 

Гомоферментативное  молочнокислое брожение. Гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют практически только одну молочную кислоту (она составляет не менее 90% всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы происходит у них по фруктозобисфосфатному пути (бактерии обладают всеми необходимыми для этого ферментами, включая альдолазу), а водород, отщепляющийся при дегидрировании глице-ральдегид-3-фосфата, передается на пиру ват: 

От стереоспецифичности  лактатдегидрогеназы (а) и от наличия  лак-татрацемазы зависит, какой продукт  образуется - D ( -)-, L( + )- или DL-молочная кислота. Лишь небольшая часть пирувата декарбоксили-руется, превращаясь в уксусную кислоту, этанол и С02, а также в аце-тоин. Количество образующихся побочных продуктов зависит, по-видимому, от доступа кислорода. 

Гетероферментативное  молочнокислое брожение. У гетерофермента-тивных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозобис-фосфатного пути - альдолазы и триозофосфат-изомеразы. Начальное превращение глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатно-му пути, т.е. через глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат (см. рис. 7.4 и 8.2). Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, который в результате тиаминпиро-фосфат-зависимой   реакции,   катализируемой   пентозофосфокетолазой, расщепляется с образованием глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата: 

Нерастущие, отмытые  клетки Leuconostoc mesenteroides сбраживают глюкозу  почти стехиометрически согласно уравнению 

с6н12о6 -> сн3-снон-соон + сн3-сн2он + со2 

в лактат, этанол и двуокись углерода. Таким образом, у этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается через ацетил-СоА и ацетальдегид в этанол (рис. 8.2). Другие гетероферментативные молочнокислые бактерии переводят ацетилфосфат частично или целиком в уксусную кислоту, что сопровождается переносом высокоэнергетической фосфатной связи на ADP с образованием АТР. Избыток водорода передается в этом случае глюкозе, из которой образуется маннитол. Глицеральде-гидфосфат через пируват превращается в лактат. Рибозу Leuconostoc mesenteroides сбраживает в лактат и ацетат. 

При сбраживании  фруктозы гетероферментативными бактериями образуются лактат, ацетат, С02 и маннитол: 

3 Фруктоза  -»   Лактат   +   Ацетат   +   С02   +   Маннитол 

Фруктоза при  этом служит акцептором избыточных восстановительных  эквивалентов: 

Фруктоза   +   NADH2   -»  Маннитол   +   NAD 

Lactobacillus plantarum (= pentosus или arabinosus) сбраживает глюкозу по гомоферментативному пути, а пентозы расщепляет с помощью фосфокетолазы, превращая в лактат и ацетат. Следует отметить, что даже такая типичная гомоферментативная бактерия, как Lactobacillus casei, хотя и сбраживает глюкозу по гомоферментативному, пути, но рибозу превращает в ацетат и лактат гетероферментативным путем. Рибоза индуцирует у нее синтез фосфокетолазы. Если клетки, выросшие на среде с рибозой, отмыть, то после этого они и глюкозу будут сбраживать как гетероферментативные бактерии. 

Брожение, осуществляемое Bifidobacterium bifidum. Гетерофермента-тивная молочнокислая  бактерия В. bifidum получила это название за 

свою V- или Y-образную форму (лат. bifidus-раздвоенный)1. Она известна тем, что преобладает в кишечнике грудных детей, особенно детей, вскармливаемых грудью. Эту зависимость ее распространения от способа кормления грудного ребенка можно было связать с потребностью бактерии в углеводах, содержащих N-ацетилглюкозамин, которые имеются только в молоке человека, но не коровы. Все представители рода Bifidobacterium-строгие анаэробы; они не переносят присутствия кислорода, и для их роста нужна атмосфера, содержащая 10% С02. С тех пор как стали известны эти необычные для молочнокислых бактерий особенности, бифидобактерии были обнаружены и в кишечной флоре взрослых людей, и во многих других местах, даже в гниющем иле, и теперь различают много видов этого рода. Бифидобактерии рас­щепляют глюкозу согласно уравнению 

2С6Н1206   ->  2СН3    СНОН-СООН   +   ЗСН3-СООН 

т.е. сбраживают ее по фосфокетолазному побочному пути. Они не имеют ни альдолазы, ни глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, но содержат активные фосфокетолазы, расщепляющие фруктозо-6-фосфат и ксилуло-зо-5-фосфат на ацетилфосфат и эритрозо-4-фосфат или глицеральде-гид-3-фосфат. Гексозы претерпевают следующие превращения: 

 Применение  молочнокислых бактерий в домашнем  хозяйстве, сельском хозяйстве  и для приготовления пищевых  продуктов. Если нестерильный  раствор, содержащий наряду с  сахарами также сложные источники азота и факторы роста, оставить без доступа воздуха или просто налить в сосуд достаточно большое количество такого раствора, то вскоре в нем появятся молочнокислые бактерии. Они снижают рН до значений < 5 и тем самым подавляют рост других анаэробных бактерий, которые не могут развиваться в столь кислой среде. Какие именно молочнокислые бактерии вырастут в таких накопительных культурах, зависит от прочих условий. Благодаря своему стерилизующему и консервирующему действию, основанному на подкислении среды, молочнокислые бактерии используются в сельском и домашнем хозяйстве и в молочной промышленности. 

Приготовление силоса. Молочнокислые бактерии, обитающие  на растениях, играют большую роль при  запасании впрок кормов для скота. Для приготовления силоса используют листья сахарной свеклы, кукурузу, картофель, травы и люцерну. Растительную массу прессуют и прибавляют к ней мелассу, чтобы повысить отношение C/N, и муравьиную или какую-либо неорганическую кислоту, чтобы заранее обеспечить преимущественный рост лактобацилл и стрептококков. В таких условиях происходит контролируемое молочнокислое брожение. 

Приготовление кислой капусты. Кислая капуста тоже представляет собой продукт, в приготовлении  которого участвуют молочнокислые  бактерии. В мелко нарезанной, посыпанной солью (2-3%) и спресованной белокочанной капусте при исключении доступа воздуха начинается спонтанное молочнокислое брожение, в котором принимает участие сначала Leuconostoc (с образованием С02), а позднее Lactobacillus plantarum. 

Молочные продукты. Молочнокислые бактерии, образующие кислоту и придающие продуктам определенный вкус, находят широкое применение в молочной промышленности. Стерилизованное или пастеризованное молоко или же сливки сбраживают, прибавляя в качестве закваски чистые («стартовые») культуры молочнокислых бактерий. Кисломолочное масло готовят из сливок, сквашенных с помощью Streptococcus lactis, S. cremoris и Leuconostoc cremoris. Образующийся в процессе брожения диацетил (см. стр. 289) придает маслу  специфический  аромат. 

Закваски, содержащие Streptococcus lactis или Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus, вызывают свертывание казеина  при приготовлении творога и  немецких сыров (гарцского и майнцского). При изготовлении твердых сыров (в отличие от сыров из кислого молока) для свертывания казеина пользуются сычужным ферментом. Молочнокислые бактерии (Lactobacillus casei, Streptococcus lactis) вместе с пропио-новокислыми участвуют лишь на стадии созревания сыров. 

Для приготовления  молочнокислых продуктов (табл. 8.3) в качестве заквасок тоже используются стартовые культуры молочнокислых бактерий, образующих кислоту и некоторые вещества, придающие продукту характерный запах. Ароматное пахтанье получают с помощью упомянутых выше заквасок, применяемых для приготовления кисломолочного масла. Пахтанье наряду с молочной кислотой содержит также уксусную кислоту, ацетоин и диацетил. Йогурт получают из пастеризованного гомогенизированного цельного молока, инокулированного Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus (после внесения закваски молоко выдерживают 2-3 ч при 43-45°С). Под названием биогурт в продажу поступает кислое молоко, сквашенное Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus. Кефир принадлежит к молочнокислым продуктам, содержащим кислоты и этанол; его получают из молока (коровьего, овечьего или козьего). Закваску готовят на так называемых кефирных зернах, которые состоят из пока еще не полностью изученного сообщества организмов, включающего лактобациллы, стрептококки, микрококки и дрожжи. Сквашивание молока ведут при 15-22°С в течение 24-36 ч. Для приготовления кумыса используют ослиное молоко1, которое инокулируют культурой, содержащей Lactobacillus bulgaricus и дрожжи рода Torula.