Мінорні компоненти та жирнокислотний склад поверхневих ліпідів деяких видів рослин

     Газову  хроматографію жирних кислот проводили за Richnow [2003] на хроматографі НР 6890. Розподіл жирних кислот проводили у вигляді метилових естерів. Газова хроматографія проводилась безперервним способом з терміном очистки 0,16 хв. Ін’єкція проводилась при температурі 180 єС. Проба вносилась в кількості 4 μl.

     Газову  хроматографію вуглеводнів проводили на тому ж хроматографі й при тих самих умовах розподілення, що для полярних компонентів, але з іншим температурним режимом.

     Процес  та ідентифікація компонентів при газовій хроматографії здійснювався за допомогою мас-спектрометричної приставки НР 5973 (Hewlett Packard, USA) та програми Enhansed Chem. Stations G 1701 AA Var 03.00.

     Визначення  співвідношення стабільних ізотопів Карбону в компонентах ПЛ проводили за Schleffus [2003] на хроматографі GC-С-irmMS-gas chromatography / combustion / isotope-ratio-monitoring mass spectrometry – газова хроматографія з наступними розкладанням та мас – спектрометричним визначенням співвідношення ізотопів. (FINNIGAN MAT–252, Bremen, Germany). Співвідношення ізотопів Карбону у індивідуальних компонентах розраховували шляхом порівняння із стандартними СО₂ з певним вмістом ізотопів ¹²С, ¹³С та ¹⁴С з відповідними масами 44, 45 і 46 та наступним визначенням величини іонного потоку. 

РЕЗУЛЬТАТИ  ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розробка  сучасних методичних підходів до вивчення біохімічних особливостей поверхневих ліпідів  рослин. У цьому розділі автором обговорюється застосування методів хроматографічного розподілення і аналізу мінорних компонентів та жирних кислот ПЛ ,  а також застосування таких методів хромато-мас-спектрометрія, компонент-специфічний ізотопний аналіз, ДТА, ІЧ-спектроскопія для вирішення поставлених задач.

     Жирні кислоти поверхневих  ліпідів хвойних. Застосування сучасних методичних підходів дало можливість ідентифікувати у фракції жирних кислот ряд нових сполук, які практично не згадуються в оглядових роботах, присвячених біохімії ПЛ. Окрім звичайних кислот у фракції жирних кислот нами знайдені сполуки, наявність яких у ПЛ не обговорювалася раніше.

     Розгалужені кислоти мали таку загальну формулу (рис. 1):

  n = 11, 13 n = 12, 10

     Знайдено  дикарбонові кислоти загальної  формули:

n = 7, 11 n = 12

та аліциклічна  кислота

     Рис .1 Незвичайні жирні  кислоти поверхневих ліпідів.

     Синтез  розгалужених кислот відбувається внаслідок  залучення до біосинтезу включення  розгалужених амінокислот [Mukherji, 2003]. Циклопропановий  фрагмент може синтезуватися внаслідок  приєднання групи -СН₃ до подвійного зв’язку (донор SAM) [Bao, 2003]. Дикарбонові кислоти синтезуються при окисненні кінцевої групи -СН₃ відповідної монокарбонової кислоти [Kulattukudy, 1981]. Оскільки вищезгадані сполуки знайдено вперше ПЛ тканинах рослин, це підтверджує існування цих біосинтетичних систем у епідермальних тканинах рослин.

     Незвичайні  жирні кислот за виключенням аліциклічної кислоти знаходяться у невеликій  кількості в ПЛ досліджених рослин (0,12-2,75 % до суми жирних кислот), що дозволяє віднести їх до мінорних компонентів. Аліциклічна кислота не може бути віднесена до таких компонентів, оскільки її вміст відповідає вмісту основних, мажорних кислот (до 28,31 % у ПЛ Picea abies другого року). кількісне визначення незвичайних кислот дало можливість говорити про видоспецифічність та онтогенетичну залежність їх біосинтезу. Наприклад, розгалужені кислоти гептанового ряду повністю відсутні в ПЛ Picea pungens та знайдені в невеликих кількостях тільки в ПЛ листя першого року інших рослин. Вміст аліциклічної кислоти підвищується з віком листя, або залишається на високому рівні у ПЛ листя другого та третього року.

     Мінорні компоненти поверхневих  ліпідів хвойних. Застосуваня методичних підходів, описаних вище, дозволило виділити та охарактеризувати ряд сполук терпеноїдної природи у ПЛ хвойних, які знаходились у невеликих кількостях і які раніше майже не обговорювались при вивченні ПЛ рослин.

Серед них – похідні абієтанової (1 - 5) та пімаранової (6 - 8) кислот (рис. 2)

     Рис. 2 Дитерпенові похідні  поверхневих ліпідів

      Дитерпени були знайдені лише у ПЛ Picea abies і Pinus pallasiana. Здебільшого у сучасних хвойних знайдено похідні абієтанів, які містять ненасичене шестичленне кільце. За своєю ненасиченістю 4 ,5 сполуки подібні до розповсюджених, але містять замісники (окиснені метилові групи, метокси групи), що не спостерігалося раніше. Також практично відсутні згадки про терпеноїди типу 1,2,3 у яких третє кільце частково відновлене. Отже, усі похідні абієтанової кислоти знайдені нами вперше. Похідні пімарової кислоти є гомологами абієтанів, які відрізняються на одне етиленове угрупування. Такі сполуки також не знайдено в тканинах хвойних [Otto, 2003], отже, вони характерні лише для ПЛ листя. Вміст абієтанової кислоти досягав 23,45 % у ПЛ Picea abies першого року. Показано переважання дитерпенів на першому році онтогенезу. Для дитерпенів, на відміну від тритерпенів, характерний немевалонатний шлях біосинтезу, всі реакції якого проходять в стромі пластид [Martin, 2002].

     Існування терпеноїдів з різноманітними функціональними  групами в захисному ліпідному  шарі може бути пов’язане з необхідністю формування групи речовин, що забезпечують гетерогенну суміш, здатну підтримувати певний “молекулярно-динамічний стан” поверхневих тканин. Такий стан потребує наявності, з одного боку, високомолекулярних гідрофобних речовин, які роблять вагомий внесок в “аморфну” частину ПЛ, з іншого боку - полярних речовин, або частин молекул, що забезпечують здатність до асоціації та формування кристалічної фази.

     Показано  наявність в ПЛ сквалену та п-кумарової  кислоти. Попередник три терпенів сквален був характерний для ПЛ Picea pungens, найбільше його (0,71 %) спостерігалося на першому році онтогенезу. п-Кумарова кислота була характерна для ПЛ лише представника роду Pinus (0,4 %).

     Біохімічні  характеристики поверхневих  ліпідів хвойних з частковим пошкодженням крони. Вивчалися загальні характеристики ПЛ, такі як ІЧ-спектри та ДТА сумарних фракцій ПЛ досліджуваних рослин. Розглянемо їх зміни на прикладі ПЛ Pinus pallasiana (табл. 1).

Так, ІЧ-спектри  контрольних та дослідних рослин відрізнялись областю карбонільного  поглинання. Інтенсивність двох смуг поглинання, які відносяться до груп, змінювалися під впливом токсикантів. При цьому, як онтогенетичні, так і екзогенні фактори мали однакове спрямування: збільшувалася інтенсивність поглинання більш короткохвильової смуги (1725 - 1740 см^-1) у порівнянні з більш довгохвильовою смугою (1640 - 1650 см^-1). Обидві смуги відносяться до валентного коливання карбонільної групи. Оскільки в ПЛ хвойних оксо-сполуки (альдегіди та кетони) відсутні, аналогічні зміни спектральних характеристик свідчили про зміну жирнокислотного складу ПЛ у процесі онтогенезу [Берзеніна, 2000], ми припустили, що в умовах токсичної дії екзогенних речовин відбуваються перебудови ПЛ (синтез de novo одних компонентів, розклад інших, або разом), які включають біосинтез жирних кислот. Необхідно відмітити, що ІЧ-спектральні характеристики застосовані нами вперше для оцінки екзогенного впливу на склад ПЛ.

    Таблиця 2

    Параметри ендотермічних переходів  поверхневих ліпідів  листя хвойних  різного віку контрольних  рослин (к) та рослин з частковим пошкодженням крони (д)

     Перший  ендотермічний ефект було знайдено тільки для рослин, які вирощувалися у контрольних умовах. Цей низькотемпературний  ефект без мінімуму відносять  до переходу аморфної фази ПЛ в кристалічну [Reynhardt, 1994]. Отже, відсутність такого переходу у рослин з частковим пошкодженням крони може бути пояснена зниженням інтенсивності біосинтезу тих компонентів ПЛ, які утворюють аморфну фазу (естери, вуглеводні і т. і.) внаслідок впливу токсикантів.

     Другий  ендотермічний ефект характеризує перехід кристалічної фази в рідку, тобто плавлення ПЛ. Він має чіткий мінімум, що характерний для плавлення кристалічних сполук і відноситься до більш полярних компонентів ПЛ. У ПЛ під впливом токсикантів має місце зміна параметрів цього переходу: він має набагато більший розмір, розтягнутий інтервал, що свідчить про значно більшу гетерогенність полярних сполук. При дії токсикантів також зростає величина температурного інтервалу. Це також характерно для збільшення вмісту більш полярних, здатних до асоціації, сполук (табл.. 3).

     У ПЛ контрольних рослин спостерігається  збільшення на 12 % вміст високомолекулярних кислот з віком. При пошкодженні крони вміст довголанцюгових жирних кислот на 12 % зменшується. Ці дані співпадають з даними ДТА про зростання гетерогенності при дії токсикантів. Отже, вплив токсикантів викликає гальмування процесу елонгації жирних кислот.

     В той же час вміст С₁₈ - жирних кислот (С_18:0, С_18:1, С_18:2) зростає здебільшого у всіх досліджених зразках під дією токсикантів. Для ПЛ Pinus pallasiana зростання характерне для першого року, де під впливом вміст С₁₈ - жирних кислот збільшується на 1,13 %, в той же час вміст ненасичених кислот під впливом токсикантів зростає на 3,25 %.

     Вміст аліциклічної кислоти зростає з 0,01 % для рослин контрольної групи  до 45 % під дією токсикантів на першому  році і, відповідно, зменшується з 18,95 % до 16,55 % на другому році. А вміст  дитерпенів зростає з 10,77 % для рослин контрольної групи до 17,45 % під дією токсикантів на першому році і, відповідно, з 1,6 % до 17,8 % на другому році.

     Жирні кислоти та мінорні  компоненти поверхневих  ліпідів водних рослин. У складі ПЛ водних рослин (табл. 3) нами був встановлений підвищений вміст ненасичених жирних кислот, жирних кислот з непарною кількістю атомів Карбону та вмісту кислот з довжиною ланцюга С₁₆, С₁₈ (табл. 4).