Мінорні компоненти та жирнокислотний склад поверхневих ліпідів деяких видів рослин

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ  БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА  
 
 

ШЕПЕЛЕНКО Вадим Миколайович 
 
 

УДК 577.115+665.322 
 
 

Мінорні компоненти та жирнокислотний склад поверхневих  ліпідів деяких видів  рослин 
 
 
 
 

03.00.04 - Біохімія 
 
 
 

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук 
 
 
 
 
 
 

Київ - 2005 
 

Дисертацією є  рукопис. 
 

Робота виконана в Дніпропетровському національному  університеті

Міністерства  освіти і науки України. 
 

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

                  ШТЕМЕНКО Наталя Іванівна,

                  завідувач кафедри  біофізики та біохімії

     Дніпропетровського  національного університету 
 

Офіційні опоненти:  доктор біологічних наук, професор

                  СТАРОДУБ Микола Федорович,

                  головний науковий співробітник

                  відділу біохімії біосенсорних та регуляторних систем

                  Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна; 
 

кандидат  біологічних наук, старший науковий співробітник ОКАНЕНКО Олександр Аркадійович,

                  старший науковий співробітник

лабораторії фізіологічних основ продуктивності рослин кафедри фізіології та біохімії рослин 

Київського  національного університету

ім. Тараса Шевченка. 
 

Провідна установа -  Чернівецький національний університет

     ім. Ю. Федьковича МОН, кафедра біохімії. 

Захист  відбудеться “7” червня 2005 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9. 
 
 

З дисертацією  можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9). 
 
 

Автореферат розісланий “6” травня 2005 р. 
 

Вчений  секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01,

кандидат  біологічних наук                           Кірсенко О.В. 
 

ЗАГАЛЬНА  ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ 

     Актуальність  теми. Поверхневі ліпіди (ПЛ) – гетерогенна суміш естерів (восків), алканів, спиртів, оксосполук, жирних кислот та мінорних компонентів, що розташовані на поверхні листя рослин та мають загальну властивість – гідрофобність – завдяки значній величині (С₁₂-С₃₆) вуглеводневого радикалу [Bianchi, 1984, 1989, 1995; Prasad 1990; Post-Beitenmiller, 1996; Kunst, 2003; Reynhardt, 1991, 1994; Barthlott, 1998].

     У роботах співробітників кафедри  біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету [Штеменко, 1997, 1998, 1999, 2000, 2003; Берзеніна, 1997, 2000] проведено детальний огляд свідчень про ПЛ листя рослин, розроблено методичні підходи до вивчення ПЛ, з’ясовано особливості формування ПЛ рослин у процесі онтогенезу. Однак у переважній кількості вищезгаданих робіт не використовувався такий новітній метод досліджень як хромато-мас-спектрометрія. Саме цей метод спроможній визначити структуру біомолекул, що знаходяться в невеликій кількості (мінорні компоненти) навіть у складній суміші. Також практично не застосовувався метод компонент-специфічного ізотопного аналізу ПЛ, який дає можливість вивчати особливості ферментативних реакцій, що є чутливими не тільки до конфігурації молекул, а й до розміру (складу) ядра елемента. Останнім часом доведено, що ПЛ не є інертним нерухомим шаром, якому притаманна тільки бар’єрна або захисна (від ультрафіолетового випромінювання) функції. Показано, що в умовах пристосування до факторів зовнішнього середовища відбуваються певні перебудови ПЛ, які мають за основу біосинтез нових компонентів та зміну гідрофобності шару [Bianchi, 1995; Jetter, 2001]. У цьому аспекті хвойні (Coniferae) є одними з найважливіших об’єктів, оскільки ці види характеризуються широким ареалом розповсюдження, високою стійкістю та використовуються людиною у фіторемедіаційних заходах. Деякі водні рослини є теж цікавим об’єктом досліджень, оскільки склад ПЛ їх практично не вивчався взагалі і вони застосовуються для очистки води [Stottmeister, 2003].

     Отже, застосування сучасних методів дослідження  для визначення структури компонентів ПЛ рослин та їх змін під впливом факторів зовнішнього середовища є актуальним напрямком досліджень, оскільки вносить суттєвий внесок у розуміння взаємозв’язку структура біомолекул – функція, що є однією з центральних проблем сучасної біохімії.

     Мета  і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення складу жирних кислот, мінорних компонентів та проведення компонент-специфічного ізотопного аналізу ПЛ деяких видів хвойних та водних рослин.

     Для досягнення мети були поставлені задачі : 

• Провести хромато-мас-спектрометричний аналіз сумарної фракції жирних кислот хвойних та водних рослин.
• Визначити зміни молекулярно-динамічних характеристик та складу ПЛ хвойних рослин в умовах адаптації до шкідливих факторів середовища.
• Визначити величину дискримінації важкого ізотопу ¹³С у компонентах ПЛ хвойних та водних рослин.
• На основі отриманих даних розглянути можливі шляхи біосинтезу окремих компонентів.

Об’єкт  досліджень. Особливості жирнокислотного складу та мінорних компонентів поверхневих ліпідів хвойних та водних рослин.

Предмет досліджень. Компоненти поверхневих ліпідів хвойних та водних рослин.

Методи  досліджень. У роботі використані методи екстракції поверхневих ліпідів, методи хромато-мас-спектрометрії, компонент-специфічного ізотопного аналізу, диференційного температурного аналізу, інфрачервоної спектроскопії, статистичного аналізу.

     Наукова новизна отриманих  результатів. Вперше показано наявність у фракції жирних кислот поверхневих ліпідів розгалужених (ізо - та антеізо пента - та гептадеканові кислоти), аліциклічних (дициклопропанова кислота), та дикарбонових (дикарбоксинонаноат, дикарбокситридеканоат, 12-метил-тетрадеканоат) кислоти. Серед мінорних компонентів поверхневих ліпідів рослин знайдено терпеноїди класів абієтану та пімарану, фенольні кислоти, функція яких вірогідно полягає у підтриманні впорядкованості структури поверхневих ліпідів та підвищенні температури фазових переходів “кристалічна-аморфна” фази. Показано значну дискримінацію стабільного важкого ізотопу ¹³С у вищих жирних кислотах та вуглеводнях поверхневих ліпідів рослин, яка найбільш суттєва для довголанцюгових компонентів. Вперше показано значну ненасиченість поверхневих ліпідів водних рослин, яка обумовлена наявністю пальмітоолеїнової, олеїнової та лінолевої кислот. Вперше виявлено, що в умовах пристосування до факторів зовнішнього середовища відбувається перебудова шару поверхневих ліпідів за участю мінорних компонентів та незвичайних жирних кислот, що підкреслює важливість їх функцій у формуванні поверхневого шару з певними молекулярно-динамічними характеристиками. На основі отриманих даних обговорені нові аспекти біосинтезу окремих компонентів поверхневих ліпідів рослин.

     Практичне значення отриманих  результатів. Результати проведених досліджень дозволяють більш глибоко проаналізувати причинно-наслідкові зв’язки між складом та хімічною будовою поверхневих ліпідів рослин різного віку і формуванням гідрофобного біохімічного бар’єру, здатного захистити фотосинтетичний апарат від зовнішніх впливів. Зроблені спостереження і висновки значно розширюють уявлення про механізми функціонування різноманітних біосинтетичних процесів в епідермальних тканинах рослин.

     Зв’язок роботи з науковими  темами. Робота виконувалась в рамках бюджетних тем лабораторії НДІ біології і кафедри біофізики та біохімії ДНУ “Розробка біотехнології отримання речовин із рослинної сировини для практичного використання” (0196U00259), “Дослідження процесів формування ліпідного і білкового комплексів рослин” (0199U00129), які входять в координаційний план № 15 Міністерства освіти і науки. Частина роботи виконувалась згідно гранту Німецької служби академічних обмінів (DААD) № А/03/12911.

     Особистий внесок здобувача. Розробка програми й основної  гіпотези наукової проблеми виконана разом з науковим керівником – доктором біологічних наук, професором Н.І. Штеменко. Представлена дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених та узагальнених протягом 2001-2004 рр. Автором дисертаційної роботи особисто були проводені експериментальні дослідження, здійснені підбір та обробка літературних даних, статистична обробка результатів. Друковані праці підготовлені за особистою участю здобувача.

     Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи, були представлені на міжнародних конференціях: Sixth International Symposium & Exhibition of Environmental Contamination in Central & Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States 1-4 September 2003, Prague, Czech Republic; 1st European Symposium on Plant Lipids: From Fundamental Biology to Industrial and Field Applications, Aachen, 10-13 September; V Регіональній конференції молодих учених з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2002); ІІ Всеукраїнській конференції молодих вчених з актуальних питань хімії (Дніпропетровськ, 2004).

     Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (1 розділ, 7 підрозділів), експериментальної частини (3 розділи, 16 підрозділів), висновків, списку використаних джерел який налічує (157 найменувань). Робота виконана на 133 сторінках і включає 40 рисунків, 22 таблиці.

     Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт, з яких 3 статті, надруковані в спеціалізованих фахових виданнях та за кордоном.

     ОСНОВНИЙ  ЗМІСТ РОБОТИ

 

     Огляд літератури. В огляді літератури розглянуті відомі на сьогодні дані про склад жирних кислот та мінорних компонентів поверхневих ліпідів рослин. Розглянуто основні шляхи біосинтезу окремих компонентів поверхневих ліпідів.

     Матеріали і методи досліджень. Матеріалами досліджень були окремі дерева таких видів: Picea abies L. Karst, Picea pungens Engelm, Pinus pallasiana D.Don, Pinus sylvestris, які росли на території Ботанічного саду Дніпропетровського національного університету (контрольна група) та на ділянці з інтенсивним автотранспортним рухом міста Дніпропетровськ (досліджувана група), де спостерігалося часткове пошкодження крони. Відбір проводився на стадії активної вегетації. Вивчалося листя різного віку (першого, другого та третього років), яке було зібране із середнього ярусу південно-східної сторони крони. Також для досліджень були взяті водні рослини Juncus effusus L. та Typha latifolia L., які вирощувались як гідропонічні культури на середовищі: 50 % розчин Хогланда на водопровідній воді у фітолабораторії Цетру вивчення навколишнього середовища (Лейпциг, Німеччина) за Stottmeister [2003]. Експерименти проводились в 3 - 4 біологічних повторностях.

     Екстракцію  поверхневих ліпідів проводили за схемою Гусакової [1986].

     ДТА зразків проводили на дериватографі системи Паулік-Паулік-Ердей марки Q-1500 D (MOM) в динамічному режимі в умовах звичайного теплообміну в інтервалі температур 10-500 ⁰С зі швидкістю нагрівання 10 ⁰С / хв, еталон - Al₂O_3. при масі зразків 0,1 г і реєстрації кривих диференційного температурного аналізу з максимальною чутливістю.

     Аналіз  інфрачервоних спектрів поглинання ПЛ проводився на спектрометрі Speсord UR-20 у вигляді суспензії речовини у вазеліновому маслі на оптичному склі з броміду калію.

     Гідроліз сумарних ПЛ, реекстракція та отримання двох ліпідних фракцій - неомилюючих речовин та жирних кислот проводили за Кейтсом [1975].

     Отримання метилових естерів  жирних кислот, дитерпенових кислот та фенольних кислот проводили за Сriestie [1998].

Попередньо  метильовані компоненти ПЛ розподіляли методом колоночної хроматографії на силікагелі G 60 [Otto, 2003] з такими розчинниками: гексан– отримували фракцію вуглеводнів; дихлорметан– відкидали; етилацетат– отримували фракцію вільних жирних кислот, фенольних кислот, терпеноїдів у вигляді метилових естерів.